军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

杨日芳恽榴红

摘要进化化学作为化学和生物学的交叉学科，系在实验室中应用达尔文进化论，通过定向分子进化来发明与改良功能生物大分子；可用于获得接头、催化性多聚核酸、催化抗体等功能性生物大分子。该文综述了这一领域的主要进展及其在药物研究与开发（如先导化合物的发现和新型诊断与治疗方法的设计）中的应用。

关键词：进化化学；离体选择与进化；药物研究与开发；接头；催化性多聚核酸；催化抗体

所有自然界存在的酶均是基于自然选择的达尔文进化的产物^［1］。受自然界中达尔文进化成就的启发，科学家们开始掌握和应用这一进化理论，在实验室中完成达尔文进化，这不仅包括生物机体与细胞水平，还包括在单个的生物大分子水平上。

达尔文进化主要包括重复进行的三个过程：选择、扩增和变异^［2］。

选择，不管是自然的或人工的，均是一个从“不富有者(the have-nots)”群体中分离“富有者(the haves or the fecund)”的扬弃过程。在实验室中，富有者则是那些能满足实验人员所附标准要求的分子^［3］。

扩增，就是产生子代；更确切地说，就是备份遗传基因。在实验室中，实验人员将选择与扩增关联，仅使那些能满足所附标准要求者产生子代。确切地说，不是所选分子本身，而是它们的基因被扩增^［4］。

变异，就是引入变种。定向分子进化的功效在于巨大数量的力量和分子多样性^［1,4］。

贯穿于达尔文进化全过程的是适应，即适者生存。自然选择只不过是保持基因原有功能的机制，而进化的发生主要是重复基因获得了的新功能的结果。

生物学中两大不同的分支——群体遗传学和生物技术有了富有成果的结合，其共同的兴趣在于应用优化药物、抗体和酶连续的变异、选择和遗传所导致的适应性增加^［1］。只有当基因型和表型相关联时，进化才有可能发生，这就是所谓的“强制进化”^［2］、定向分子进化^［3］、离体遗传学^［4］、离体选择^［5］或离体进化^［6］。

定向分子进化就是在分子水平上应用达尔文进化，通过多轮的选择、扩增和变异，可以促使群体生物大分子向任意功能目标进化，从而获得或改良功能大分子。定向分子进化可以满足生产全新的工业试剂与新药^［3］。

离体进化实验研究进化群体对控制的选择压力所作的基因型和表型应答。研究揭示，与自然进化一样，人工进化群体表现出适应性反应：在进化过程中随着变异体发生变异而波动。尽管进化群体中多样性增加，在（核）酶周边区域，表型中度改变而基因型改变占支配地位；在核心区域则极少有突变，此处多样性极低^［7～10］。结果表明，进化群体在局部适应性优化中被限止。为获得更高的适应性，须经过考察更广泛的变异体，或从更早期的群体中重新开始进化过程，或者通过不断积累周边区域的中性突变，使群体跨过一些较不利的中间体，达到更好的适应性改善^［1,7］。通过改变或加强选择的限制条件，可以达到获得或拓宽生物大分子的功能（如催化活性），甚至增加其专一性。

在生物大分子进化领域中主要有核酸(DNA和RNA)分子进化和蛋白质分子进化。可以用于研制“智能配体或接头(aptamer)”^［6］、核酸药物^［5］、核酸酶^［6］、脱氧核酸酶^［11］、受体和抗体酶^［8,9］。

1核酸分子进化

核酸分子进化基础是DNA的PCR与3SR技术和RNA的变温扩增技术RT-PCR^［3,4,11］，新的序列变异体则通过应用PCR的突变形式产生^［11］。以随机或半随机化学合成寡核苷酸来建立序列变异体库，再应用自然选择或非自然选择来分离含所需性质的分子；这种分离系基于其特殊的配体结合性质、催化性质或其他可使分子富集的性质。无限期的、连续多轮的选择和扩增使得离体定向进化成为可能^［4］，成功的关键在于起始库的选择和选择压力或限制条件的合理设计，起始库中含有10¹¹～10¹⁵个不同序列^［3,7］，典型的重复轮数为3～15轮。

离体选择或离体进化常被认为是1990年发明的^［5,12］，但核酸的定向进化可追溯到60年代Spiegelman等对噬菌体Qβ复制酶的重复离体复制实验^［13］，离体进化实验包括许多不同的目的和不同的选择策略。在定向进化实验中，不管哪类大分子作离体选择，第一步就要组建一个差异分子群体(库)，这包括三种策略^［3］：⑴总括策略：即设计包括定义限制的所有可能变异体的全序列大分子；⑵猎枪(shotgun)策略：即设计随机差异的序列大分子，用于猎取具有新型性质的分子；⑶聚焦策略：即以具有某一特性的分子为母序列，引入随机突变，精炼或改良特定的分子性质。

指数富集式配体系统进化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX)已被广泛用于分离能与靶蛋白或小分子高亲和力结合的RNA和DNA分子，这些分子被称为“智能配体或接头”^［6］。能与蛋白靶分子作用的接头可用硝酸纤维素滤膜捕获或以初始聚丙烯酰胺凝胶分离，而能与小分子结合的接头则可用亲和层析分离^［5］。该技术可用于研制核酸药物^［5］；还可用于研制新的核酶。一方面，可以利用其结合基态底物的性质，加上突变、扩增重筛其催化性质；另一方面，应用类似于生产催化抗体或抗体酶的工艺，直接筛选能与过渡态类似物结合的“催化性智能配体或接头(catalytic aptamer)"^［6］。

离体选择和离体进化已超越其研究基础情节，已拥有了发现有治疗应用前景的先导化合物和设计新型诊断方法的成果^［5］。

1.1接头

1.1.1核酸药物

最近研制了三种能增加接头与靶分子亲合性的方法^［5］：⑴悬挂能引导与靶分子特定部位结合的小分子（如弱的抑制剂）；⑵交联酶的自杀性底物，使与靶分子共价结合；⑶杂合光敏核苷酸。

为使接头更适应作药物，需增加核酸的分子稳定性并减小分子，采用的方法有^［5］：⑴以DNA分子库代替RNA分子库；⑵引入化学修饰（包括前取代和后取代策略）；⑶进行构象限制性最小化：分割重要的功能残基和支架残基，以化学连接链取代支架残基［如取代环(loop)区和引入刚性连接链］；特别是二硫键策略：系在核苷酸中引入化学活性基团——巯基，利用二硫键将接头部位特异地交联，不致引起接头大的构象变化。

接头在体活性包括^［5］：⑴阻断基因表达，如可阻断许多胞外细胞素的功能；⑵抑制酶的代谢作用；⑶调节复杂的代谢过程。其给药系统同反义药物。

1.1.2对传统药物研制的影响

1.1.2.1鉴定药物作用靶标^［5］离体选择能准确定义核酸靶分子的序列和结构；定义DNA靶分子；也能帮助定义核酸以外的靶分子，因为接头不仅能作渊源或功能相关的蛋白靶分子的特异性探针，也能作相同靶分子的不同状态或构象的探针。

1.1.2.2药物设计事实上，即使接头自身不适于作药物，也可以用作药物模型。具体体现在：

⑴“反向药物发现”法^［5］。一方面，通过绘制氨基糖苷类药物结构与核酸序列的相关图谱，可以提供老药可能的新作用靶；另一方面，通过与基因库中全序列的相同序列比较，可以发现许多潜在的作用靶。氨基糖苷以外的小分子化合物也能作反向药物发现法的候选对象，这不仅可用于发现抗核酸药物；而且，通过确定接头∶配体络合物的结构，可提示蛋白∶药物络合物中的作用特性，如堆集作用和氢键网络。

接头与小分子结合的选择性和结构特性使人相信，离体选择将有助于形成药物发展规划的新基础；描绘化合物结构与核酸序列关系的数据库的无穷作用最终必将在从头设计特异性抗核酸药物的研究中得到证实。筛选化学组合库与反向药物发现法结合，将在细胞或病毒基因组的研究中产生幸运的“成功(hits)”：产生分子识别“码(codes)”——这一合理药物设计的基础^［5］。

⑵核酸模拟物^［5］。正如肽模拟物可在选择噬菌体肽库或蛋白结构所发现的活性肽的结构基础上设计合成一样，核酸模拟物也可在接头的序列和结构基础上设计合成。

⑶对化学组合库设计的影响^［5］。从某种意义上讲，核酸分子库实际上是可复制的化学库。

其可复制性和易得性使得分子可通过多轮的选择、扩增和变异，来促使活性化合物之间的竞争，而得到进化，精制得到少数几个对某一靶标分子具有最大亲和力或效力或所需的分子性质的个体分子。借鉴这一特性，在普通的化学组合库中通过链接一个供筛选的标签、一个地址(locale)或一个编码的可复制或不可复制的标签^［14］，普通有机分子库也能重新合成与重复筛选，这种化学库实际上也具备了可复制性。