第二军医大学学报2000年第21卷第4期

邵建伟吴宗贵李莉张玲珍仲人前孔宪涛

摘要目的：探讨三氧化二砷（As₂O₃）诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的作用。方法：建立大鼠VSMCs增生模型。用四甲基偶氮唑蓝还原反应（MTT法）、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法观察As₂O₃诱导VSMCs凋亡的作用。结果：经As₂O₃作用后VSMCs出现典型的凋亡变化，透射电镜下可见细胞核仁消失，染色质浓缩聚集于核膜下。DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯形电泳条带。流式细胞术检测出现典型的凋亡峰，并随As₂O₃浓度的增加和作用时间的延长而增高。对照组均不见上述变化。结论：As₂O₃可有效诱导VSMCs凋亡。

关键词：三氧化二砷；血管平滑肌细胞；凋亡

经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）已成为公认有效的冠状动脉狭窄治疗手段，但术后较高的再狭窄（RS）发生率严重影响了其远期疗效，因此RS的防治已成为重要的研究课题。目前认为RS的主要病理基础是血管平滑肌细胞（VSMCs）大量增殖，其发生与肿瘤的发生有相似的分子生物学机制，有人甚至将RS比做VSMCs的良性肿瘤^［1］。因此，保持VSMCs增殖和凋亡的平衡就成为防治RS发生的重要途径之一。由于RS治疗给药途径的改进以及诱导凋亡的抗肿瘤药物在RS防治中的作用已被人们所认识，As₂O₃作为抗肿瘤药物的新军，也以其疗效佳、副作用少而日益受到世界医学界的重视。本实验观察了As₂O₃诱导体外培养的VSMCs的凋亡作用，旨在为其用于临床治疗RS提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验细胞参考王道生^［2］贴块法行SD大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)VSMCs原代培养：大鼠断头处死后，无菌条件下迅速取出胸主动脉，置无菌PBS缓冲液中，冲净凝血块，剥离外膜，刮去内膜，将中膜用PBS缓冲液洗净剪碎，铺满培养瓶底部，翻转培养瓶，使组织块位于培养瓶的上方，加入含20%胎牛血清(NCS)的DMEM培养液，拧紧瓶口，置于37℃，5%CO₂的培养箱中，7 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，然后静置培养。1周后可见细胞从组织块边缘爬出，2～3周出现致密细胞层，此时可传代。细胞经抗肌动蛋白抗体免疫组化染色，鉴定为平滑肌细胞。实验用细胞均为6～10代传代细胞。

1.2主要试剂As₂O₃为Sigma公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；小牛血清为Hyclon公司产品；溴化乙啶（PI）为Coulter公司产品；MTT试剂、pGEM-7Zf/HaeⅢ marker为上海华美试剂公司产品。

1.3四甲基偶氮唑蓝还原反应（MTT法）将单细胞悬液以10⁴个/ml的密度接种在96孔板上，200μl/孔。次日细胞贴壁后换上0.5% NCS-DMEM培养液37℃,5%CO₂培养56 h，使细胞基本同步于G₀期，再换用10% NCS-DMEM培养液，分实验组和空白对照组，每组3块板（分别培养24，48，72 h），加药组As₂O₃浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0μmol/L，设5个复孔，37℃,5%CO₂培养箱内培养。实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，以波长570 nm测定各孔光密度（D）值。以时间为横轴，D值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.4透射电镜观察将不同浓度（1.0～5.0 μmol/L）的As₂O₃与VSMCs共育(37℃,5%CO₂)12,24,36,72 h，并设相应时间点的对照组。将每组细胞（10⁶个/ml）洗脱,置于尖底离心管，PBS缓冲液洗2次，1000 r/min离心5 min，去上清，沿管壁滴入2.5%戊二醛及1%锇酸固定，乙醇脱水，环丙烷置换，环氧树脂浸透，用胶囊法包埋。超薄切片经电子染色后，透射电镜（H-500）观察超微结构并摄片。

1.5琼脂糖凝胶电泳将不同浓度（1.0～5.0 μmol/L）的As₂O₃与VSMCs共育(37℃,5%CO₂)48 h，设未加药组为阴性对照。将每组细胞（5×10⁶个/ml）洗脱，2000 r/min离心4 min，去上清，用PBS缓冲液1 ml重悬细胞，并转入Eppendorf管中，同法离心，去上清，用PC缓冲液40μl重悬细胞，37℃过夜。加入0.25% NP-40溶液3 μl，RNase A溶液3 μl（1 mg/ml），置37℃，30 min。加入蛋白酶K溶液3 μl，置37℃，30 min。PI染色，点样于2%琼脂糖凝胶；6 v/cm电泳2 h，紫外线（302 nm）透照，观察电泳条带并摄片。

1.6流式细胞术检测同上法制备标本，细胞经PBS缓冲液洗2次，离心后弃上清，加1 ml PBS缓冲液悬浮细胞，并加入50 μl含0.1% Triton X-100 的PI（5 μg/ml）染色，避光放置15 min（室温），上机检测。采用MUTICYCLE软件（Phoenix公司）分析结果，低于G₀/G₁期DNA含量的细胞为凋亡细胞。

1.7统计学处理实验数据以±s表示，采用方差分析。

2结果

2.1MTT 法检测结果终浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0μmol/L的 As₂O₃与5×10³个/ml的VSMCs共育不同时间后，可见细胞生长受到抑制，并且该抑制作用随浓度的升高和时间的延长而明显增强（图1）。当4.0μmol/L As₂O₃分别作用24，48，72 h后细胞数逐渐下降，各时间点间有显著性差异(P＜0.05)；当作用时间为72 h时，随 As₂O₃浓度的增加，细胞数明显下降，各浓度组之间有显著性差异(P＜0.05)。

图 1不同浓度As₂O₃对VSMCs的作用

fig 1Effect of different concentration of As₂O₃ on vSMCs○:Control; △:1.0 μmol/L; ●:2.0 μmol/L;▲:3.0 μmol/L; ■:4.0 μmol/L; ◆:5.0 μmol/L

2.2透射电镜对照组VSMCs细胞周围微绒毛完整，细胞核形态规则，核仁清晰，细胞内可见大量内质网（图2A）。用As₂O₃处理后细胞微绒毛消失，胞内大量空泡形成，胞质浓缩，核仁消失，核染色质固缩，呈境界分明的新月形、块形，聚集于核膜下，内质网扩张呈泡状与胞浆膜融合（图2B）。并且随As₂O₃浓度的增加和作用时间的延长凋亡特征更加明显。

图 2血管平滑肌细胞超微结构(×4800)

fig 2Electron micrograghs of ultrastructure in VSMCs(×4 800)

a:Control group; B:As₂O₃ group

2.3琼脂糖凝胶电泳不同浓度As₂O₃作用于VSMCs24 h后，细胞凋亡在琼脂糖凝胶电泳获得模糊DNA梯形条带，36 h获得较清晰并呈一定间隔的DNA梯形条带，有别于细胞坏死时的模糊的片状条带（无间隔），并且DNA梯形条带的清晰度随As₂O₃浓度的增加而更明显（图3）。

图 3血管平滑肌细胞DNA电泳观察

fig 3DNA fragmentation of agarose gel

electrophoresis of VSMCs

1:As₂O₃ 4.0 μmol/L ； 2:As₂O₃ 3.0μmol/L ；3:As₂O₃ 2.0 μmol/L ； 4:As₂O₃1.0 μmol/L ；

c:Control； M:pGEM-7Zf/HaeⅢ marker

2.4流式细胞术检测流式细胞术检测显示：（1）DNA直方图出现DNA降解的亚G₁凋亡峰（AP峰）；（2）随着As₂O₃作用时间（图4）或浓度（资料未显示）的增加，AP峰增高。空白对照组不显示AP峰。提示As₂O₃对凋亡的诱导具有剂量与时间的依赖关系。

图 4As₂O₃诱导VSMCs凋亡时间效应图

fig 4Time-dependent effects of As₂O₃ on VSMCs apoptosis

4.0 μmol/L As₂O₃ incubated with VSMCs

for 0,2,4,8,12,48 h respectively

3讨论