中国医学科学院学报2000年第22卷第3期

臧梦维沈琦孙越汪青刘景生

摘要目的观察阿片激动剂急性和长时程作用于稳定表达iNOS基因的NG-LNCXiNOS细胞，对细胞内游离钙(［Ca²⁺］_i)的影响及G-蛋白的调节作用。方法应用共聚焦显微镜和荧光探针Fluo-3，监测单细胞［Ca²⁺］_i含量变化。结果δ-阿片激动剂 DPDPE 和吗啡急性刺激细胞诱发［Ca²⁺］_i增加，纳洛酮对其起翻转作用；用百日咳毒素预处理细胞后，吗啡急性刺激不能引起［Ca²⁺］_i增加；DPDPE 和吗啡长时程处理细胞，再用相应的阿片激动剂急性刺激也造成［Ca²⁺］_i增加，但［Ca²⁺］_i增加水平较低，用纳洛酮戒断造成［Ca²⁺］_i明显增加。结论阿片激动剂诱发［Ca²⁺］_i增加是由阿片受体介导的，受对 PTX 敏感的 G-蛋白调节，当细胞发生阿片耐受和依赖时，表现为受体介导Ca²⁺系统的脱敏现象。

关键词：δ-阿片受体阿片类药物依赖细胞内游离钙G-蛋白共聚焦激光扫描

NG108-15细胞含有δ-阿片受体、NMDA受体等，是研究受体后信号传导机制的良好细胞模型，但其诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达很低，为研究NMDA-NO-cGMP信号系统在阿片耐受依赖形成中的作用，笔者以 NG108-15 细胞为靶细胞，获得稳定表达重组iNOS 基因的 NG-LNCXiNOS 细胞株^［1，2］，用阿片激动剂长时程作用于该细胞株，对腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)-cAMP 系统抑制效应减弱，用纳洛酮急性戒断，cAMP反跳性增加，表现为阿片受体脱敏和下调，从而建立阿片耐受和依赖的细胞模型^［3］。为进一步了解δ-阿片受体和细胞内游离Ca²⁺浓度(［Ca²⁺］_i)的关系，本研究应用新型荧光探针 Fluo-3 负载细胞，用激光扫描共聚焦显微镜动态监测荧光值变化以反映单细胞［Ca²⁺］_i含量，观察阿片激动剂急性和长时程作用于 NG-LNCXiNOS 细胞对［Ca²⁺］_i的影响及G-蛋白的调节作用。

材料和方法

药品和仪器高选择性δ-阿片受体激动剂 DPDPE (D-Pen²，D-Pen⁵-enkephalin),吗啡，纳洛酮，百日咳毒素(pertussis toxin，PTX) 和荧光染料探针 Fluo-3/AM 为 Sigma公司产品；共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。

细胞株和细胞培养神经母细胞瘤和神经胶质瘤的杂交 NG108-15 细胞常规培养方法参照文献［4］。参照文献［1，2］ 的方法建立稳定表达 iNOS 基因的克隆 NG-LNCXiNOS 细胞株。

样本制备采用 Fluo-3/AM 荧光法^［5］。细胞密度1×10³/ml，Fluo-3 终浓度 2 μg/ml， 共聚焦激光扫描显微镜测定，有稳定荧光值基础值后，观察加药前后细胞的荧光值变化。

共聚焦激光扫描显微镜观察参照文献［6］的方法。采用 5 W 氩离子激光，激发波长为全波长。采集数据间隔时间为10～20 s,并绘制药物引起胞内Ca²⁺荧光值变化的时间曲线。

结果

阿片激动剂急性刺激引起胞内［Ca²⁺］_i增加及纳洛酮的翻转作用在NG108-15 细胞培养皿中加入终浓度为 100 nmol/L 的 DPDPE，可见［Ca²⁺］_i逐渐升高至2.7，再向培养基中加入 10 μmol/L纳洛酮，其荧光值逐渐下降(图1)。

图 1δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发 NG108-15 细胞

［Ca²⁺］_i增加及纳洛酮的拮抗作用

fig 1Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on ［Ca²⁺］_i and antagonistic action of naloxone in neuroblastoma×glioma hybrid NG108-15 cell

A.DPDPE; B.naloxone;* measured value/basal value

图 2δ-阿片受体激动剂 DPDPE 急性作用诱发细胞［Ca²⁺］_i增加及纳洛酮的拮抗作用

fig 2Acute effect of the selective δ-opioid receptor agonist DPDPE on ［Ca²⁺］_i and antagonistic action of naloxone in NG-LNCXiNOS cell

a.DPDPE；B.naloxone;*measured value /basal value

在新建立稳定表达 iNOS 基因细胞，预先加入同样浓度 DPDPE，荧光值由基础水平升高至2.5，加入10 μmol/L纳洛酮后，荧光值逐渐下降，但仍高于基础水平(图2)。若预先加入10 μmol/L纳洛酮，本身不引起［Ca²⁺］_i升高，然后再加入100 nmol/L DPDPE，［Ca²⁺］_i荧光值仍处于基础水平，未出现［Ca²⁺］_i增加的反应(图3)。本实验还观察到10 μmol/L 吗啡刺激［Ca²⁺］_i增加，荧光值接近3.0，但10 μmol/L纳洛酮可完全拮抗吗啡使［Ca²⁺］_i增加的作用(图4)。

G蛋白对阿片激动剂诱导胞内Ca²⁺变化的调节作用在未用 PTX 预处理的NG-LNCXiNOS细胞，吗啡诱导［Ca²⁺］_i升高(图4)；而用 100 ng/ml PTX 预孵细胞24 h ,再加入10 μmol/L 吗啡，测定［Ca²⁺］_i荧光值几乎没有变化，PTX完全阻断吗啡诱导［Ca²⁺］_i升高的效应(图5)。

图 3纳洛酮(10 μmol/L)阻断DPDPE诱发的细胞［Ca²⁺］_i增加

fig 3DPDPE-induced［Ca²⁺］_i elevation was blocked by naloxone(10 μmol/L) in NG-LNCXiNOS cell

a.naloxone;B.DPDPE;*measured value /basal value

图 4 纳洛酮拮抗吗啡诱导的NG-LNCXiNOS 细胞［Ca²⁺］_i增加

fig 4The morphine-induced ［Ca²⁺］_i increase was antagonized by naloxone in NG-LNCXiNOS cell

a.morphine;B.naloxone

图 5百日咳毒素(100 ng/ml)预处理 NG-LNCXiNOS 细胞对吗啡诱导［Ca²⁺］_i增加的影响

fig 5Effect of pertussis toxin (100 ng/ml) pretreatment on morphine-induced increase in ［Ca²⁺］_i in NG-LNCXiNOS cell

a.DPDPE；* measured value/basal value

图 6纳洛酮对 DPDPE 长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞［Ca²⁺］_i增加的影响

fig 6The effect of naloxone on ［Ca²⁺］_i increase induced by long-term pretreatment with DPDPE in NG-LNCXiNOS cell

a.DPDPE；B.naloxone;* measured value /basal value

阿片激动剂长时程作用对胞内Ca²⁺的调节作用用l μmol/L DPDPE 长时程处理细胞 48 h,再用100 nmol/L DPDPE 急性刺激细胞，［Ca²⁺］_i荧光值上升至1.5左右，若加入10 μmol/L 纳洛酮荧光值持续上升达4.5，阿片类物质长时程作用可引起胞内Ca²⁺增加程度减弱，表现为 DPDPE 急性诱发［Ca²⁺］_i增加作用发生脱敏(图6)。

用10 μmol/L吗啡预孵细胞48 h，再加入l μmol/L吗啡急性刺激，使［Ca²⁺］_i增加至1.5左右，加入10 μmol/L 纳洛酮急性戒断引起［Ca²⁺］_i荧光值异常升高为4.0(图7)。

图 7纳洛酮对吗啡长时程作用诱发 NG-LNCXiNOS 细胞［Ca²⁺］_i增加的影响