中国医学科学院学报1999年第21卷第1期

孙庆华朱元珏许文兵曾煊

摘要目的通过地塞米松对白介素-5(IL-5)诱导的EOS存活的影响，探讨地塞米松治疗哮喘的作用机制。方法将外周血的EOS加入IL-5和不同浓度的DEX共同培养，以观察DEX对IL-5诱导的EOS存活的作用。结果大于5pg/ml水平的IL-5明显提高EOS的存活，且有剂量依赖性；Dex以剂量依赖的方式抑制EOS的存活，从50nmol/L开始，1000nmol/L的Dex抑制达到最强；而当IL-5浓度为100pg/ml或更高时，其诱导的EOS存活不能被任何浓度的DEX所抑制。Dex对EOS存活的作用有时间依赖性，其抑制作用在高浓度的IL-5存在条件下可延迟或消失。结论Dex对疾病的治疗可能存在着抵抗，而高浓度的IL-5可抵消Dex对细胞的作用。

关键词：哮喘嗜酸粒细胞白介素-5地塞米松

支气管哮喘(以下简称哮喘)的特征之一是大量活化的嗜酸细胞(EOS)浸润支气管粘膜，EOS增多的程度与气道高反应性的严重性有关^［1］。EOS产生的介质可导致哮喘的许多病理特征。例如，上皮脱屑被认为是通过分泌颗粒蛋白的细胞毒性作用而发生的^［2］。糖皮质激素是临床上治疗与EOS增多相关疾病的最有效药物之一。本实验通过Dex对白介素-5(IL-5)诱导的EOS存活作用的影响，进一步探讨Dex对哮喘的作用机制。

1材料和方法

富含EOS的豚鼠腹膜渗出液的制备根据改良Gleich^［3］方法，每次取10只DH豚鼠(中国医学科学院实验动物研究所提供)。在每只豚鼠腹腔内注射2ml的马血清，每周一次，连续8周，第9周进行灌洗。2%戊巴比妥钠腹腔注入麻醉，右下腹外侧切开，塑料导管引入，用100ml生理盐水(含肝素20u/ml)灌洗腹腔，腹腔液引流到50ml的离心管中，1500r/min离心15min。收集管底细胞团。

分离EOS将管底细胞团重悬于密度为1.070g/ml的percoll液(含10%FCS)，细胞数(0.5～1)×10⁸/ml。按Gartaer^［4］方法配制不同浓度的percoll液(Pharmicia)。在10ml离心管中依序加入以下密度的percoll液：1.100液1ml，1.090、1.085、1.080液各1.5ml，含待分离细胞的1.070液1ml，4000r/min离心20min(20℃)，回收密度为1.100和1.090percoll液交界的细胞层，用Hanks液稀释至5ml，再以2500r/min离心15min，洗细胞，弃上清，Hanks液洗2次管底细胞团，重悬于Hanks液(含BSA2mg/ml)，调细胞数为2×10⁹/L。取少许涂片，Wright染色，分类，EOS占95%以上，苔酚兰染色检查细胞活性，EOS活力在95%以上。

EOS存活的测定纯化的EOS在37℃、5%CO₂条件下培养。96孔板每孔加RPMI1640液(含青、链霉素和10%小牛血清)200μl、EOS悬液20μl(细胞数为2×10⁵/L)。分别于第1、2、3、4天测定其活性。EOS的存活通过荧光染色(FDA和PI)、用血细胞计数器和荧光显微镜(OlympusBH-2，PM-10AD)计数。EOS存活率的计算：%=［活细胞/(活细胞+死细胞)］×100%。

IL-5对EOS的活力增强活性的测定方法同上，同时在每孔中分别加入适量rhIL-5(Genzyme,Boston,MA,)，使其终浓度分别为0、2、5、10、50、100、500、1000、5000pg/ml，培养至第4天测定其存活。

Dex对IL-5诱导的EOS存活的抑制作用EOS与rhIL-5(终浓度50pg/ml)和不同浓度的Dex(Sigma,Chemicalcompany),共同培养至第4天计数，观察Dex对IL-5诱导的EOS的抑制作用。Dex溶于二甲基亚砜(DMSO)溶媒中，浓度为1mol/L，存于-20℃，临用前以RPMI1640稀释，作为每一实验的对照。抑制率以下列公式计算：抑制%=(Vmed-Vdex)/Vmed×100%

Vmed=仅有细胞因子介质的存活率；Vdex=有地塞米松和细胞因子的存活率。

将EOS和终浓度分别为0、10、50、100、500、1000pg/ml的rhIL-5与不同浓度的Dex共同培养，第4天测定EOS活性，计算每一Dex浓度的EC₅₀值，观察不同浓度的IL-5条件下Dex对EOS存活的抑制作用。EC₅₀是能够使EOS的存活率提高50%的IL-5浓度；50%存活率提高的计算为(最大存活率-Vp)/2+Vp。其中最大存活率为最理想的IL-5浓度所产生的EOS的存活率；Vp为实验给定浓度的IL-5和Dex所产生的EOS的存活率。为测定Dex作用的时间变化，培养基中分别加入浓度为50和500pg/ml的IL-5，再观察不同浓度Dex对EOS存活率的影响，于培养的第4天计数。

将EOS和终浓度分别为50和500pg/ml的IL-5与不同浓度的Dex共同培养连续4天测定EOS活性，进一步观察Dex对EOS存活抑制作用的时间效应。

统计学方法实验数据用均数加减标准差表示，采用配对t检验。每组实验重复3次，每样本设3孔。

2结果

IL-5对EOS存活的增强作用培养基中无IL-5时，EOS培养到第4天存活率仅为43%，并且其存活率随天数增加继续下降，当培养基中加入IL-5(＞5pg/ml)后，EOS的存活率明显升高，并从50pg/ml的IL-5开始达到一平台，显示EOS的存活对IL-5具有剂量依赖性。

Dex对IL-5诱导的EOS存活的影响将EOS与不同浓度的Dex共同培养至第4天，随着Dex浓度的增高，EOS的存活率逐渐下降，Dex以剂量依赖的方式抑制EOS的存活；以DMSO代替Dex作对照，对EOS的存活无影响。提示Dex对EOS的存活有剂量依赖性抑制，从50nmol/L开始，1000nmol/L的Dex抑制达到最强。

高浓度IL-5存在条件下Dex对EOS存活的失抑制通过不同浓度的IL-5，进一步研究Dex对IL-5诱导EOS存活的作用。结果显示，Dex虽对EOS的存活有影响，但随着IL-5剂量的增加(＞50pg/ml)，EOS的存活率逐渐升高，且显示IL-5剂量依赖曲线右移。而当IL-5浓度为100pg/ml或更高时，其诱导的EOS存活活性不能被实验设定的任何浓度的Dex所抑制。

Dex对EOS存活影响的时间依赖性当以50pg/ml的IL-5与Dex及EOS共同培养时，于培养的第2天可观察到EOS的活性抑制。而将IL-5浓度增至500pg/ml时，直到培养的第4天才见到EOS活性的明显抑制。

3讨论

1949年，Hench等首先报道了糖皮质激素(GC)在类风湿性关节炎治疗中的抗炎作用。并认识到与EOS有关的疾患对GC有特别的反应，即GC可使正常人的EOS减少。并使患病机体的外周血EOS下降。GC也可降低皮肤、痰液、支气管灌洗液和鼻粘膜等炎症部位的EOS浸润。GC在临床中的抗炎作用虽已被公认，但却不清楚它在EOS相关炎症中的作用机制。有研究表明，IL-5与人骨髓细胞中的成熟EOS共同培养，IL-5对EOS有刺激作用而使其细胞毒性增强^［5，6］。提示IL-5有提高EOS功能的作用。本实验观察到，Dex对IL-5诱导的EOS存活活性具有剂量依赖性抑制作用。Dex抑制的时间过程依赖IL-5浓度。例如，在50pg/ml的IL-5浓度下，培养的第2天可观察到Dex的存活活性受抑制，将IL-5浓度增加10倍，直到培养的第4天才可见到明显的活性抑制，高浓度的IL-5可延迟或中止Dex对IL-5诱导的EOS活性的抑制。

近来已有许多证据有力的证明了IL-5为EOS的活化因子。离体及在体实验中，IL-5可增加EOS的数量、增强成熟EOS潜在的毒性作用。迄今的研究表明，GC部分地通过抑制EOS细胞因子的释放而发挥其临床作用。本研究结果表明，Dex可能通过拮抗EOS分泌细胞因子IL-5的作用而降低其活力，提示Dex在体内可能直接作用于EOS以降低其数量，并因此减少其毒性。这一结果与Lamas等^［7］报道的GC抑制GM-CSF介导的EOS活力的结果相一致。GC还对EOS趋化与粘附等有抑制作用。EOS表面存在GC受体。Prin等^［8］报道，其受体的缺乏与临床上EOS增多征的GC抵抗有关。

体外实验中Dex对EOS活力的抑制是否与体内Dex的临床效果有关尚不清楚，但其前景令人感兴趣。笔者曾观察到抗IL-5抗体在体外对EOS的存活及趋化性有抑制作用，与国外研究结果吻合。例如，特发性高EOS综合征患者的血浆在体外可提高正常人EOS的存活，且此存活可被IL-5抗体所抑制^［9］。EOS活性抑制的时间过程也与支气管哮喘等疾病中GC作用的临床观察相一致，虽然在GC治疗开始的几个小时内所见的EOS下降可能会由于细胞重新分布所致，但在随后几天内临床改善的时间过程则与实验所观察的存活抑制基本相符。GC对EOS存活的抑制为研究细胞因子对EOS的作用提供了一个有用的借鉴。高浓度IL-5下Dex失去其抑制作用的结果提示，哮喘治疗中可能存在GC抵抗，而高浓度的IL-5可抵消Dex对细胞的作用。

作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学协和医院呼吸内科，北京100730

参考文献

[1]Durham SR, Kay AB. Eosinophils, bronchial hyperreactivity and late phase asthmatic reactions. Clin Allergy, 1985, 15:411～418

[2]Gleich GJ, Frigas, E. Loegering DA. Cytotoxic properties of the eosinophil major basic protein. J Immunol, 1979, 123:2925～2927

[3]Gleich GJ, Loegering D. Selective stimulation and purifi cation of eosinophils and neutrophils from guinea pig peritoneal fluids. J Lab Chin Med,1973, 82:522～528

[4]Gartaer I. Separation of human eosinophils i