电流和静息电位及膜电容影响

中华耳鼻咽喉科杂志1999年第34卷第4期

梁勇钟乃川

摘要目的：探讨水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞(outer hair cell，OHC)钾电流(potassium current，I_K)、静息电位(resting potential，RP)和膜电容(membrane electric capacitance，MEC)的影响，分析水杨酸钠影响毛细胞功能的细胞电生理机制。方法：应用膜片钳全细胞记录技术，测试0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠用药前后OHC的I_K、RP和MEC变化。结果：水杨酸钠对I_K的影响具有时效和量效关系，即用药后有I_K先增加后降低的双相作用，而高浓度水杨酸钠无论是对I_K的增加作用还是降低作用都比低浓度时明显。RP平均约为-60 mV，MEC平均约为39 pF。水杨酸钠有降低RP和MEC的作用，且均存在着量效关系，即高浓度时的作用大于低浓度时。水杨酸钠对RP和MEC影响的时效关系不明显。结论：水杨酸钠具有影响OHC两侧膜的K⁺电导和细胞内外K⁺分布的作用，并通过对I_K、RP和MEC的影响改变OHC的兴奋性和机械活动特性，可能是水杨酸影响毛细胞功能的耳蜗机制之一。

关键词：水杨酸钠膜电位毛细胞外钾通道外向钾电流膜电容

耳蜗毛细胞上的离子通道是细胞内外离子转运和离子电流形成的基础，钾通道和钾电流(potassium current，I_K)对毛细胞的频率调谐、静息电位和兴奋性等生理功能起重要作用。离子通道的活性、离子的通透性和细胞内外离子的分布决定了细胞的静息电位(resting potential，RP)，也称膜电位（membrane potential)，生理或非生理(如药物)刺激可改变膜两侧的电化学梯度，导致膜电位改变和跨膜电流形成，引起细胞兴奋性变化。膜电容(membrane electric capacitance，MEC)是细胞膜作为绝缘层将细胞内外导电液分隔开而具有的电容器特性，其电容量等于在膜电位下从膜一侧转移到另一侧的电荷量，并与细胞的表面积有关。外毛细胞(outer hair cell，OHC)受某些因素刺激发生运动时可伴随着体积和表面积等形状的改变^［1-3］，这种变化可引起MEC的变化，而MEC的变化与细胞的长度变化呈对应关系，因此膜电容测试可以反映OHC的运动特性及其与OHC电流变化的关系^［3］。

水杨酸具有导致可逆性耳聋和耳鸣的耳毒性，有人提出作用部位是在耳蜗，且可直接作用于OHC，影响毛细胞的K⁺、Ca²⁺、Cl^-电导，从而影响毛细胞的机电转换和机械特性等生理功能^［4］，这一作用有可能对OHC的RP和兴奋性乃至MEC和运动性产生影响。我们以水杨酸钠为实验药物，采用膜片钳全细胞记录技术观察了用药前后豚鼠单离OHC的I_K、RP和MEC的变化，以此探讨水杨酸钠对OHC生理功能影响的细胞电生理机制，亦为耳蜗性聋和耳鸣的发病机制研究提供依据。

材料与方法

一、毛细胞分离

健康杂色豚鼠，体重250～380 g，雌雄不限，耳廓反射灵敏。快速断头，取下颞骨，打开听泡，置于Hank液。显微镜下剥去骨性蜗壳，取下基底膜并置入含0.25 mg/ml木瓜蛋白酶的Hank液中，20℃消化10～12 min，再用无酶Hank液清洗2～3次。用含0.25 mg/ml牛血清白蛋白的Hank液孵育1～2 h。

二、溶液配制与药物

Hank细胞外液(单位：mmol/L)：NaCl 137.0，KCl 5.4，MgCl₂ 1.0，CaCl₂ 1.3，羟乙基哌嗪乙胺磺酸［N-(2-hydroxyethl)piperzine-N′-(2-ethanesulfonic acid), HEPES］5.0，葡萄糖5.0，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.3，以95%O₂+5%CO₂混合气体充气至饱和。

细胞内液(电极内液，单位：mmol/L)：K-aspartate 85.0，KCl 45.0，Na-pyravate 5.0，MgCl₂ 4.0，乙二醇乙二胺四醋酸［ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-teraacetic acid, EGTA］ 10.0，HEPES 10.0，K₂-ATP 5.0，葡萄糖11.0，用1.0 mol/L KOH调pH至7.3。

水杨酸钠(Sigma公司，美国)用蒸馏水配成0.01 mol/L溶液备用。

三、微电极准备

取经预处理后的微电极玻璃毛坯(直径1.6 mm)，以二步法拉制后抛光，使电极尖端电阻为3～5 MΩ。充灌电极内液并固定于操纵器的固定杆上。

四、全细胞记录

1．细胞封接：取数滴细胞混悬液滴于置于倒置显微镜载物台上的多槽玻片上，高倍镜下选定形态和活性正常的OHC，将电极末端调入槽液中，补偿液接电位至零。在显微镜直视下，用微操纵器小心调节电极末端与细胞表面轻轻接触后，施以负压，使之与细胞膜形成高达10 GΩ以上的高阻封接。再施以负压吸破细胞膜，与细胞外近似绝缘，形成全细胞记录状态。根据需要对串联电阻和电容进行补偿。

2．记录仪器、条件和参数：仪器为PC-Ⅱ型膜片钳放大器(华中理工大学)。全部记录在屏蔽防震工作台上进行，室温20～30℃。

I_K：钳制电位为－70 mV。指令电压刺激：每秒给予一100 ms的阶梯式脉冲指令电压刺激，从－40 mV开始，以10 mV为一档逐渐升至+60 mV。为抑制钠电流，在每次指令电压刺激前先施一100 ms的－50 mV钳制电压。

RP：将电流钳制至零，在无电压刺激下记录膜两侧的电位差，即RP。

MEC：钳制电位为0，将快电容补偿调至零位，在2个连续的25 ms中分别给予－10和+10 mV的微弱电压刺激，利用相位敏感法由内设程序计算MEC。

3. 记录内容：于用药前和用药后(给药浓度为0.1和1.0 mmol/L)3、10和20 min分别作以下记录：①各指令电压下的I_K电流峰值、绘出I_K的电流-电压相关曲线，计算量效和时效关系；②RP；③MEC。

4．数据处理与分析：所有数据均在计算机显示、储存和读取，并以±s表示，配对t检验作统计学处理，比较和分析用药前后数据的变化及特点。

结果

一、毛细胞分离

一般情况下，每侧耳可分离出形态和活性正常的单离毛细胞约40～120个，毛细胞形态和活性正常的判别标准参照苏振伦等^［5］报道的方法。

二、水杨酸钠对I_K的影响

图1a、b分别为0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠在用药前和用药3、10和20 min后的I_K记录结果及其电流-电压相关曲线。I_K在加药3 min后增加，10 min后开始降低，20 min时降低更为明显。表1为2种浓度药物在指令电压60 mV时对I_K的影响，用水杨酸钠对I_K影响的增减率表示(以下RP和MEC的表示法相同)：增减率(%)=［I_K(用药后)－I_K(用药前)］/I_K(用药前)。在用药后3、10和20 min，高浓度的影响均比低浓度明显。以上结果表明，水杨酸钠对I_K的影响具有剂量效应和时间效应关系，并具有先增加后抑制的双相作用。

图10.1 mmol/L（a）和1.0 mmol/L(b)水杨酸钠对钾电流的影响及其电流-电压相关曲线的变化

三、水杨酸钠对RP的影响

图2a、b分别为0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠在用药前和用药3、10和20 min后所记录的RP平均值。用药前RP平均约为－61 mV，用药后则降低(绝对值增加)。与用药前相比，0.1 mmol/L水杨酸钠使RP显著降低(t值分别为3.25、4.16和5.78，P值均＜0.05)，降低率分别为8.3%、11.1%和12.2%。1.0 mmol/L水杨酸钠这使RP极显著降低(t值分别为7.50、8.46和10.30，P值均＜0.01)，降低率分别为20.3%、23.3%和26.1%。

图2应用0.1 mmol/L（a，n=4） 和1.0 mmol/L（b，n=5）水杨酸钠前后RP的平均值

四、水杨酸钠对MEC的影响

图3a、b分别为0.1和1.0 mmol/L水杨酸钠在用药前和用药3、10和20 min后记录的MEC平均值。用药前MEC平均值约为39 pF，用药后则降低。与用药前相比，0.1 mmol/L水杨酸钠使MEC显著性降低(t值分别为3.14、4.51和5.60，P值均＜0.05)，降低率分别为10.6%、13.2%和17.7%；1.0 mmol/L水杨酸钠使MEC极显著性降低(t值分别为14.14、15.86和13.01，P值均＜0.01)，降低率分别为21.2%、23.8%和34.7%。

图3应用0.1 mmol/L（a，n=4）和1.0 mmol/L（b，n=5）水<