第一军医大学南方医院骨科（广州市510515）

张新宇（综述）史占军金大地（审校 ）

关键词：肿瘤细胞多药耐药性机理研究

在肿瘤的治疗方法中，化疗占据着不可替代的地位。自从化疗药物应用于临床以来，虽对少数恶性肿瘤的治疗取得了成功，但在大多数恶性肿瘤中收效却不大，这其中1个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。1970年Bielder和Riehm发现，P388细胞及中国仓鼠肺细胞对放线菌素D产生抗药性的同时，对结构与作用机理不同的药物如长春新碱、丝裂霉素等也产生交叉抗药性^（1），这与以往认为的肿瘤细胞只对同1类型的药物产生抗药性，而对不同类型的药物仍敏感的观点不同，这种现象即被称为多药耐药（multidrug resistance，MDR）。近年来，随着对肿瘤药物治疗的进一步研究，探索肿瘤细胞多药耐药的机理并加以有效逆转，已成为肿瘤研究领域急待解决的问题。现对近些年肿瘤多药耐药机理的研究情况加以概括，希望对以后的研究有所帮助。

1 P-糖蛋白和mdr1基因

1976年Juliano等在研究中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）对秋水仙碱和其它作用于膜的药物的交叉耐药性时发现，具有交叉耐药性的细胞内药物积聚发生障碍，进一步研究发现这种细胞表面有1种分子量为170KD的糖蛋白存在，这种糖蛋白只在变异的具有交叉耐药性的CHO细胞表面存在，而在原代CHO细胞表面则没有，作者将其命名为P-糖蛋白（P-glycopro-tein，P170），并认为这种糖蛋白可以改变细胞膜疏水区对药物的通透性^（2）。1986年美国国立癌症研究院发现了多药耐药基因mdr1^（3）。

现在已经知道，拥有P170的肿瘤细胞摄入药物的能力与敏感细胞没有差异，但药物外排能力却加强，表明P170能调节细胞膜通透性以影响药物在细胞内积聚。P170由1280个氨基酸残基组成，其中肽链占140KD，糖链占30KD，P170的N端与C端形成对称结构，且氨基酸序列有高度同源性，每部分各由细胞质亲水区与跨膜疏水区组成，疏水区具有通道蛋白性质，亲水区有ATP结合位点。因此，P170被认为在MDR细胞中充当能量依赖性药物外排泵^（4），但其具体过程尚不清楚。

编码P170的是mdr1基因，人的mdr1基因定位在第7号染色体长臂的第2区第1带上，含28个外显子^（5）。1986年Igor等用DNA分析和Southern杂交的方法证明其转录4．4kb的mRNA片断^（6）。Takatori等研究发现mdr1上游－131到＋10表现出启动子活性，并发现3种DNA结合蛋白，分别为NF-R1、NF-R2、NF-R3，其中NF-R2与mdr1基因转录激活的负调控有关，能与mdr1基因上ATTCAGTCA序列及GC盒结合，而ATTCAGTCA又被认为是mdr1基因转录的正调控区域A^（7）。此外，又有学者证明，在mdr1基因上游存在2个特殊区域，分别在－258～－198和－136～－76，在人KB细胞中分别与抗癌因子和热休克有关^（8）。

mdr1基因及其表达产物P170是目前研究最多的1种多药耐药机制，逆转其作用过去曾被认为是1把双刃剑^（9），因为P170在人类正常组织如肾上腺、肾脏、回结肠、直肠、肝、肺等均有较高表达，这显然与这些组织的解毒功能有关，但目前认为这种表达在耐药肿瘤细胞中更高。

另外，有人在非P-糖蛋白表达的MDR细胞中发现了1种由1522个氨基酸残基组成的膜转运蛋白含量明显高于药敏细胞，并证明是1种细胞膜ATP结合蛋白，也参与肿瘤耐药性的形成^（10）。目前，将多种与MDR有直接关系的蛋白（不包括P170）如190KD、95KD、100KD等统称为多药耐药相关蛋白（Multidrug resistance-assoiated protein，MRP），它们对MDR的影响正在越来越多地被观察到。

2、 dNA拓扑异构酶Ⅱ（topoisomerase，TopoⅡ）

topoⅡ是催化DNA拓扑异构体相互转换的1种酶。以TopoⅡ为靶点的抗肿瘤药物的作用是通过形成稳定的可切割复合物抑制DNA的复制与转录，通过对这类药物呈现耐药性的细胞的研究发现，TopoⅡ的含量与活性有所改变，如Perry等对丝裂霉素（抗TopoⅡ）的耐药株和敏感株细胞的研究中发现，耐药株的TopoⅡ活性下降^（11）。另外，在研究潘生丁增强阿霉素、米托蒽醌和鬼臼乙叉甙在耐药细胞B16VDXR中的作用机制时，Damle等认为潘生丁可与TopoⅡ相互作用，妨碍TopoⅡ抑制剂引起的DNA破坏的修复，增强了药物的细胞毒性^（12）。Fox等在研究结肠癌对米托蒽醌的耐药细胞株时，用共聚焦显微镜观察发现与米托蒽醌相关的荧光在非耐药细胞中强于耐药细胞，且主要分布在细胞质和核周围，认为米托蒽醌很可能通过慢性TopoⅡ俘获至DNA损伤不能修复，导致临床上非典型的MDR^（13）。

一般说来，TopoⅡ异常所致的MDR有以下特点：①对许多天然药物呈现抗药性，但对长春碱类则没有；②膜活性药物不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用；③药物在细胞内聚积与保留没有变化；④mdr1与P170表达未见增加；⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。

topoⅡ经纯化已得到2种有活性的同工酶，分别称做α、β，分子量分别为170KD和180KD。

3 谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶

化疗药物能与谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合而被解毒，这是在谷胱甘肽S-转移酶（glutathione s-transferase，GST）催化下发生的反应。GST不仅可催化亲电物质与GSH结合，而且GST自身也可与亲脂性药物结合增加其水溶性，促进外排而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用。

komiya等对耐顺铂的骨肉瘤细胞的研究中发现，细胞质内的谷胱甘肽和过氧化氢酶含量增高，但抑制过氧化氢酶后药物敏感性无明显提高，而抑制谷胱甘肽后药物敏感性提高70％^（14）。Kuroda等在研究同一肿瘤患者化疗前后肿瘤细胞耐药情况时发现，化疗后株与化疗前株相比，对阿霉素的耐药性增加3倍，对顺铂的耐药性增加2．7倍，但未见mdr1基因表达，而谷胱甘肽S-转移酶（GST）的水平明显升高，说明其化疗耐药性与GST活性有关，而与mdr1基因无关^（15）。在耐苯丙酸氮芥的人黑色素瘤细胞中，GST水平升高，Hansso等用GST抑制剂—依他尼酸，证明可以逆转对苯丙酸氮芥的耐药。Ciaccio等也发现依他尼酸可显著增加许多MDR细胞对烷化剂的敏感性。

以上均说明GSH和GST在一些肿瘤多药耐药机制上起重要作用。

4 蛋白激酶（proteinkinaseC，PKC）

1994年Laredo等选用2组不同特征的AML细胞，1组耐阿霉素，1组对阿霉素敏感，他们发现对阿霉素的耐药性与P-糖蛋白无关，而Staurosporine（ST）是1种PKC抑制剂，加入ST可使阿霉素的细胞毒性增加2－3倍，由此得出，PKC活性增强也是1种细胞耐药的机制^（16）。后来发现PKC的这种作用主要是通过使P170磷酸化并使其功能增强而实现的，P170做为PKC的底物，尽管数量未增加，但其药物外排功能却增强了，从而在P170并未过度表达时也产生耐药性。PKC主要催化丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，有多种同工酶，如α、β、γ、ε、δ、ζ等，各自具体的作用还不清楚。CloudHeflin等选择了KB-3（敏感株）和KB-V1（耐药株）2种人肿瘤细胞来研究PKC的作用情况，用同工酶特异抗体Immunoblotting方法，发现KB-V1中ε、δ、ζ没有变化，而α升高，与KB-3细胞明显不同，故认为PKC-α在MDR表型中起重要作用^（17），但这仅是对PKC的初步了解，因其同工酶分布不同，不同的MDR细胞中PKC的活性变化也不一致，不同的调节因子对敏感细胞和耐药细胞可通过不同的同工酶进行调节，并很可能出现一些交替变化的不确定机制^（18）。

5 与致癌和抑癌基因的关系

correntic等调查了18000例乳腺癌病人，发现有多发性癌基因改变，过度表达的是c-myc、int-2、neu和c-myb，用slotblot分析浸润癌的mRNA，发现30％的肿瘤同时有mdr1和c-myc的高水平表达^（19）。Norris等也从神经肉瘤细胞的耐药性研究中证实，MRP的表达与n-myc扩增有关，有n-myc扩增的细胞MRP基因表达高，MRP高表达者的5a生存率是57％，低表达者是94％，据此认为MRP的表达情况有预后意义，而mdr1和N-myc则没有^（20）。但上述结果却与Khyari等的研究不一致，他的研究显示，mdr-1过度表达，伴有细胞核内c-myc、c-myb表达减少，而c-fos和c-jun表达增加。这些说明MDR与癌基因有关，但不同的情况下可能有不同的解释。另外，Rafki等研究发现p53基因的表达和功能的变异与CEM-VLB细胞的耐药性有关，在MDR细胞中，野生型p53受抑制，而变异的p53可特异地激活mdr1启动子，与此对应，当用小剂量诱导药物长春花碱作用于这些耐药细胞时，p53基因表达增高^（21）。

应用不同的细胞均证明，mdr1基因与癌基因的活性有关，同时也与抑癌