中华肿瘤杂志CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY

1999年第2期No.21999

赵万洲张洪杰韩锐

关键词：端粒酶 端粒酶抑制剂 肿瘤细胞永生化

癌细胞的永生化是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特性之一，也是肿瘤生长和转移的关键。自从1989年Morin首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶”假说已为越来越多的研究结果所证实。以端粒酶为靶点研究开发新的抗肿瘤药，越来越受到人们的关注。

一、端粒、端粒酶的结构与功能

端粒(telomere)是真核细胞线形染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质构成，其端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列。人的端粒DNA序列由5′→3′方向的(TTAG- GG)_n反复串联组成，大约有2～15kb。虽然端粒序列不含功能基因，但是如果没有这些类似染色体的“帽子”结构的端粒，染色体之间就会出现端-端融合、降解、重排和染色体丢失等变化，这些变化影响染色体的正确复制和细胞的生存。

端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。目前的研究证明人端粒酶包括三个主要部分，即人端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1/TLP1)和人端粒酶催化亚单位(hTRT/hEST2)。

二、“端粒-端粒酶”假说

Harley等人提出了“端粒-端粒酶”假说。在细胞有丝分裂过程中，伴随部分端粒序列的丢失，端粒长度缩短。当端粒缩短到一定长度，可能触发某种信号，使细胞进入第一致死期M₁，此时细胞不再分裂，退出细胞周期而死亡。如果细胞被病毒转染，或者某些抑癌基因如p53、RB等突变，细胞可越过M₁期而继续分裂，端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入第二致死期M₂，这时染色体可能出现形态异常，某些细胞由于端粒太短而失去功能，导致细胞死亡。但极少数细胞在此阶段进一步激活端粒酶，使端粒功能得以恢复，维持了染色体的稳定，从而避免死亡，具有无限增殖的能力。尽管迄今还不知道端粒酶激活的具体过程，但这一假说已被一些研究证实，提示端粒酶再激活可能参与细胞的癌变过程。研究资料表明，恶性肿瘤组织端粒酶阳性率远远高于正常组织及肿瘤周围邻近组织，说明端粒酶活性与恶性肿瘤之间有较高的相关性。

三、端粒酶活性的调节

端粒酶的活性与许多因素有关，不同的细胞，同一细胞的不同形态及某些物质的协同作用都可影响到端粒酶的活性。近年的研究显示，对端粒酶活性的调控存在着多种不同的途径，对端粒酶活性调节的深入研究必将为以端粒酶为靶点的抗癌药寻找开辟道路。

1.端粒及端粒酶自身结构对端粒酶活性的调节：端粒的DNA结合蛋白，能指导端粒酶与染色体末端部位结合，保护染色体末端。在酿酒酵母中发现端粒的DNA结合蛋白Rap1蛋白是端粒酶活性的调节因子，当Rap1与端粒结合到一定数目时，可以使端粒酶发挥功能。

2.细胞周期与端粒酶活性的调节：端粒酶的活性与细胞周期关系密切。Landberg研究在乳腺癌发生发展过程中，由于细胞周期素D1或E等细胞周期调控蛋白的异常表达而导致细胞周期失调，可引起端粒酶的激活。Holt等发现HT 1080和HL-60细胞在静止期的细胞中端粒酶活性被抑制，而在分裂周期的各个时相中均可检测到端粒酶活性，但端粒酶活性在分裂周期的不同时相中也不尽相同。Zhu等的研究表明，在S期细胞中端粒酶活性最高，而G₂/M期细胞的端粒酶活性极低，表明端粒酶活性与细胞周期进程直接相关。Klingelhutz用HPV 16的E6、E7、E6/E7蛋白作用于早期人角质化细胞和哺乳动物上皮细胞，发现有端粒酶的表达，E6/E7蛋白感染的细胞比E6蛋白单独感染细胞的端粒酶表达活性高，并证明E6蛋白激活端粒酶的表达，而与p53基因无关。Wright等将能表达端粒酶的永生型细胞和缺乏端粒酶活性的正常体细胞进行杂交，获得的杂交细胞端粒酶活性受到了抑制，提示可能各种细胞都具有端粒酶的抑制机制，只不过永生型细胞的抑制调控作用失灵而已。

3.端粒酶蛋白亚基磷酸化及脱磷酸化对端粒酶活性的调节：端粒酶蛋白亚基的磷酸化及脱磷酸化可能参与端粒酶活性的调节。Ku等研究证明，细胞周期阻断剂、DNA损伤剂、TopⅡ抑制剂等对鼻咽癌细胞NPC-076端粒酶活性均无抑制作用，但蛋白激酶C抑制剂bisindolylmaleimide Ⅰ和H-7对端粒酶活性具很强的抑制作用。这种抑制作用具有特异性，对于其机理存在两种可能的解释：(1)PKC的抑制导致某些效应分子的失活，而这些效应分子对端粒酶发挥活性是必须的；(2)PKC可能直接在体内调节端粒酶的活性。最近的研究发现，磷酯酶2A能抑制人乳腺癌细胞核端粒酶活性，而内源性蛋白激酶及ATP能重新活化被抑制的端粒酶^［16］，表明蛋白质磷酸化或脱磷酸化能可逆地调节端粒酶的活性。

4.细胞分化诱导对端粒酶活性的调节：分化诱导剂对不同类型的肿瘤细胞端粒酶活性的影响不同。对多数白血病细胞如早幼粒细胞性白血病、红白血病、髓细胞性白血病及胚胎癌等，分化诱导剂在诱导分化的同时，可使端粒酶活性下降，并且细胞分化的状态与端粒酶的活性密切相关，随着细胞终末分化的进行，端粒酶的活性进行性下降。但分化诱导剂对端粒酶的活性并无直接抑制作用，推测细胞分化诱导剂对端粒酶活性的调节可能是其发挥作用的一个重要方面，端粒酶活性的抑制可能是诱导分化的效应之一，分化可能使细胞内部的基因调控发生改变，影响了端粒酶RNA或蛋白亚基的活性表达。但对于另外一些肿瘤细胞如黑色素瘤CM 73-36和神经胶质瘤Ast 812，分化诱导剂虽然能引起细胞的生长抑制及细胞形态上的成熟，但对端粒酶的活性似乎并无抑制作用。

上述结果表明，端粒酶受分化诱导剂作用活性下调并非普遍现象，这也与临床上分化治疗对白血病有效而对其它多数实体瘤无效的事实相符。对于这种现象，Sharma提出，端粒酶阳性肿瘤细胞的起源可能存在两种模式：对于多数实体瘤细胞，只有当DNA突变累积到一定程度时，端粒酶才能再激活；而对于白血病、胚胎癌等，端粒酶阳性的祖细胞可能代表了某一特定的癌细胞克隆。

5.端粒酶活性的其它调节因素：多数资料表明，端粒酶的活性与p53无关。Malas等对肉瘤细胞系及成纤维细胞的研究表明，端粒酶的活性不依赖于p53。Xu等进一步提出在RB/p53缺陷的肿瘤细胞中，单纯的pRB过度表达可以抑制端粒酶活性，逆转癌细胞的永生及其恶性表型，与p53几无相关性。另有一些资料表明，第3号染色体上存在着端粒酶活性的抑制因子，Myc原癌基因可以活化端粒酶，X线照射可以诱导端粒酶活性。

端粒酶活性调节的研究虽然已取得了一些进展，但这方面的研究仍处于探索阶段，对其确切的调节机制还不明确。目前存在的主要问题是选择何种细胞系用于端粒酶的活性调节比较合适，同一因素对不同的细胞可能产生不同的调节效果，如DNA交联剂cisplatin可以引起入睾丸癌细胞端粒酶活性的抑制，这种抑制作用具有特异性及浓度依赖性，但对于鼻咽癌细胞NPC-076，cisplatin并不引起端粒酶活性的抑制。Katakura建议以人肺腺癌细胞系A5DC7用于研究端粒酶活性的调节机制。这种细胞株的端粒酶活性受不同的外源性信号的调节，不同于细胞分化诱导剂对端粒酶活性的调节作用，也不同于细胞衰老过程中的端粒酶活性调节。

四、端粒酶抑制剂的研究与开发

早在1991年第27届美国临床肿瘤学会上提出肿瘤治疗的几套方案中，就提出端粒酶抑制剂是肿瘤治疗的一种新途径，目前有许多生物技术及制药公司正在以端粒酶为靶点，发掘端粒酶抑制剂作为治疗肿瘤的有效药物。反义核苷酸、核酶、核苷类似物、蛋白激酶C抑制剂、细胞分化诱导剂作为端粒酶抑制剂显示出极有潜力的应用前景。

1.阻断端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶活性：端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA序列互补的模板序列，针对该模板序列设计的反义核苷酸可抑制端粒酶合成端粒序列。Feng等首先用含反义人端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)的质粒转染HeLa细胞，经过23～26次倍增后，HeLa细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。Norton等设计了针对hTR模板区不同长度的反义肽苷酸(PNA)，PNA5′-TAGGGTTAGACAA抑制端粒酶活性的IC₅₀为0.9 nmol/L。PNA具有较DNA寡聚核苷酸更高的退火温度以及抗蛋白酶和核酸酶降解能力。具有5′-d(TTAGGG)序列的硫代反义核苷酸(PS-ODN)也是一种有效的端粒酶抑制剂。Meta等发现，PS-ODN不仅能有效抑制Burkitt淋巴瘤抽提物中的端粒酶活性，并能抑制淋巴瘤细胞系OMA-BL1的生长，延长倍增时间，诱导细胞凋亡。对异种移植人肿瘤的裸鼠模型，50 mg/天PS-ODN可导致原位肿瘤体积缩小以及脾转移肿瘤结节数目减少，该抑制作用呈序列特异性和剂量依赖性。

核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA。Kanazawa等设计了一种锤形核酶(Telo-RZ)，具特异性切割hTR模板区序列的功能。Telo-RZ与肝癌细胞株HepG2和Huh-7的细胞抽提物共育，端粒酶活性受到明显抑制。

2.核苷类似物对端粒酶活性的抑制：端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶，利用一些已知的逆转录酶抑制剂如AZT，AraC，ddT等核苷类似物有可能对端粒酶活性产生抑制作用。Yegorov等<