【摘要】目的：研究树突状细胞在混合淋巴细胞反应中的辅佐功能。方法：应用MTT法检测人外周血分离培养的DCs在同种异体的混合淋巴细胞反应中激发同种T淋巴细胞增殖的能力。结果：只需少量DCs，即可强烈激发同种T淋巴细胞增殖。结论：DCs是T淋巴细胞增殖反应中的重要辅佐细胞，具有良好的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。

中图分类号：R557.4文献标识码：A

文章编号：1009-4571(2000)04-0351-02

Assisted Functional Study in Dendritic Cell in Mixed Lymphocyte Reaction

SUN Guang-lian,LI Yan,MENG Hong,et al.

(Insistitute of Basic Medical Sciece,Shandong Academy of Medicl Science,Jinan 250062)

【Abstract】Obgective:To investigate the assisted function of dendritc cells(DCs)in mixed lymphocyte reaction.Methods:The proliferation ability of allogeneic T cells stimulated by dendritic cells from human periphral blood were observed by MTT method.Results:Only a little number of dendritic cells can stimulate the proliferation of allogeneic T cells efficiently.Conclusions:DCs are important assisted cells in T cells proliferation.They are potent stimulators in allogeneic mixed lymphocyte reaction.

【Key words】dendritie cell;assisted ability;MTT method;mixed lymphocyte reaction

DCs是体内功能最强的APCs，具有独特地刺激幼稚T细胞活化的能力，它不仅能原位致敏CD₄⁺T淋巴细胞，而且在体外可有效地诱导同种异体CD₈⁺T淋巴细胞增殖。DCs在体内数量极少，但骨髓及外周血的CD₃₄造血前体细胞在GM-CSF和IL-4、TNF-a的共同作用下，可在体外分化发育，生成DCs,现在在外周血中分离单核细胞，利用细胞因子诱导产生大量DCs的方法已经较成熟，一般100 ml正常人外周血可分离(1.2～2)×10⁷ DCs，并且纯度大于90%，这为更深入地研究DCs奠定了基础。本研究应用MTT法检测从外周血分离获得的DCs在同种异体混合淋巴细胞反应中的辅佐功能，结果表明，从外周血分离单核细胞进而生成的DCs，只需少量即可强烈激发同种T淋巴细胞的增殖。

1材料与方法

1.1主要试剂

rh-GM-CSF、人IL-4购自深圳晶美生物技术有限公司。淋巴细胞分离液：购自天津中科院血液病研究所。RPM1 1640 培养基，购自美国GIBCO公司。新生牛血清(自制)。MTT，3-(4，6-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-乙苯基-四唑溴盐，Sigma公司产品。MTT用0.1 M的PBS溶解至终浓度为5 mg/ml，过滤除菌，4℃保存备用。

1.2刺激细胞(DCs)的制备

取健康志愿者肝素防凝的外周全血生理盐水对倍稀释，缓缓加入盛有等量淋巴细胞分离液的离心管中，3 000～4 000 r/min，离心20 min，取界面灰黄层细胞加PBS(pH 7.2)洗涤，5 000 r/min，弃上清，取沉淀，再用PBS(pH 7.2)洗，2 000 r/min，离心10 min，共2次。以10% FCS 1640悬浮细胞置培养瓶中，37℃、5% CO₂培养2 h，轻轻反过培养瓶，弃掉培养上清，将非贴壁细胞弃掉，即得贴壁的单核细胞，补加10% FCS 1640同时加入hGM-CSF 200 ng/ml,IL-4 600 U/ml,培养至第7天，收集悬浮细胞，即为DCs。

1.3反应细胞的制备

取健康人外周血用1.2之方法制备获得单核细胞，PBS洗3次后，37℃、5% CO₂贴壁2 h,收集悬浮细胞，作为反应细胞，以1640培养液悬浮，调整浓度至1×10⁶。

1.4混合淋巴细胞反应

将刺激细胞调整浓度分别为1×10³、5×10³、5×10⁴、1×10⁵、1×10⁶，10%FCS 1640培养于96孔培养板中，每浓度设立4孔，将反应细胞按1×10⁶/孔分别加入上述各孔中，37℃、5% CO₂培养3 d后，每孔加入5 mg/ml的MTT 10 μl，继续培养4 h，然后离心，甩去上清，加入溶解液(100%DMSO)，150 μl/孔，轻轻震荡，待甲月替结晶完全溶解，10 min后，用DG-3022型酶联免疫检测仪于570 nm处，测OD值并记录结果，结果以4孔均值表示。

2结果

结果表明，DCs具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的能力，只需少量的DCs(图1)。

图1不同浓度的DCs在混合淋巴细胞中的辅佐功能

3讨论

DCs是体内最主要的抗原递呈细胞，是T细胞依赖性免疫应答的重要辅助细胞^［1，2］，DCs因其具有刺突样的特异形态而命名，目前关于DSs的分离培养方法日趋成熟，在细胞因子IL-4及GM-CSF的联合应用下，人们已经能够成功的将人和小鼠的血液、骨髓和淋巴器官中的单核细胞诱导成为具有未成熟表型的DCs^［3］，此期的DCs具有表达高水平与抗原摄取有关的分子的能力，主要参与抗原的摄取、加工、处理^［4］。随着DCs的分化成熟，它们丧失了摄取、加工、处理抗原的能力，表达高水平的MHCⅠ/Ⅱ类分子及共刺激分子B7等，从而获得递呈抗原，刺激机体产生免疫应答的能力^［5～7］。在T淋巴细胞增殖反应中，DCs是重要的辅佐细胞，在混合淋巴细胞反应中，DCs作为刺激细胞，其作用可通过反应细胞的增殖得以显示，其促进T细胞增殖的机制可能是DCs与抗原特异性的T淋巴细胞形成DCs-T簇，此时DCs上的LFA-3和粘附分子ICAM-1等可分别与T细胞上的LFA-2及CD11a发生作用，促进信号传递，同时DCs表达B7-1、B7-2等供刺激信号，这些信号协同作用，诱导了T细胞的活化，活化的T细胞分泌IL-2等因子，进一步促进了T细胞的增殖。

基金项目：本课题为山东省卫生厅资助项目(982030401)

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收稿日期：2000-03-15

修回日期：2000-04-18