【摘要】目的：探讨建立裸鼠移植脑膜瘤模型的方法，为脑膜瘤的基础研究提供实验依据。方法：将5例脑膜瘤新鲜切除组织直接接种于11只裸鼠皮下，接种的同时进行脑膜瘤细胞培养观察肿瘤移植物及培养细胞生长情况。结果：11只接种脑膜瘤新鲜组织的裸鼠有10只成瘤，1例接种物吸收。结论：脑膜瘤裸鼠皮下接种是建立脑膜瘤动物模型一种比较可靠的方法，取材得当是成功的关键之一。

中图分类号：R739.45文献标识码：A

文章编号：1009-4571(2000)04-0348-03

Experimental Study of Implantation of Human Meningiomas into Nude Mice Subcutaneously

PANG Qi,XU Guang-ming,ZHANG Long,et al.

(Dept.Neurosurgery,The Second Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan 250033)

【Abstract】Objective:To establish a reliable model of human meningioma in vivo.Methods:Solid human meningioma implants taken directly from 5 cases of surgical specimens were implanted into 11 nude mice subcutaneously.The growth of meningioma xenograft was observed.Results:All but one nude mice implanted with human meningioma cells developed subcutaneous tumor.There was no spontaneous regression of tumors.Conclusions:of human meningiomas into nude mice subcutaneously is a feasible model that may be useful for testing potential treatment regimens.

【Key words】meningiomas;implantation;nude;mice

为了建立裸鼠移植脑膜瘤模型的方法，为脑膜瘤的基础研究提供实验依据，我们进行了裸鼠脑膜瘤种植实验，结果报告如下。

1材料与方法

1.1标本来源

人脑膜瘤组织标本取材于山东医科大学第二附属医院神经外科手术切除的新鲜脑膜瘤标本，共5例。术前未做放疗及其他药物治疗。其中男2例，女3例。肿瘤标本同时作石蜡切片常规HE染色，进行病理学观察确定诊断，根据1993年WHO脑肿瘤分类进行组织学分类^［1］。其中纤维型脑膜瘤3例，脑膜内皮型脑膜瘤2例。

1.2实验动物

正常4～5周龄雌性裸鼠(nu/nu，BALB)，体重16～18 g，由中国医学科学院肿瘤医院动物中心提供。

1.3主要试剂

F10培养液为市售，含10%血清及青霉素、链霉素、二性霉素；胎牛血清、蛋白酶K、谷氨酰胺、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司。

1.4实验方法

1.4.1裸鼠处理接种前1天无菌条件下γ射线照射裸鼠4 Gy(9.6 cGy/min×4.2 min)。

1.4.2标本处理新鲜切除的脑膜瘤标本，立即置于含青霉素200 U/ml、链霉素200 μg/ml的F10液中，超净台无菌条件下去除血块、电灼及坏死组织，D-hanks液冲洗干净，将瘤组织剪碎成约1 mm³大小，移入离心管，加适量1640培养液，吹匀，1 000 rpm离心5 min，弃上清，备作肿瘤接种用。部分脑膜瘤组织按常规方法^［2］同时进行细胞培养。

1.4.3肿瘤接种从培养箱内取出裸鼠，超净台下消毒裸鼠右侧肩部皮肤，取脑膜瘤组织约3 mm×3 mm×3 mm大小，用16号穿刺针接种于皮下，每日观察肿瘤生长情况，隔日用游标卡尺测量肿瘤三维长度并计算体积。

1.4.4移植脑膜瘤染色体鉴定肿瘤接种后第11周，处死裸鼠，迅速在无菌条件下取下移植瘤，立即置于含青霉素200 U/ml、链霉素200 μg的1640培养液中，按常规进行细胞培养48 h，弃去原培养液，加入含5 μg/ml秋水仙素的新鲜培养液10 ml，37℃培养箱内继续培养6 h，进行染色体制片，Giemsa染色，观察染色体形态。

1.4.5光镜及电镜观察处死裸鼠后迅速取下移植瘤，部分组织石蜡包埋常规切片、染色，光镜观察；另一部分用6%戊二醛磷酸缓冲液固定24 h，1%S4O4后固定2 h，常规脱水、包埋、切片，日立H600型透射电镜观察细胞形态结构。

2结果

5例脑膜瘤组织分别接种于11只裸鼠，其中1例未见有肿瘤生长，同时进行的细胞培养见脑膜瘤标本中含有较多的纤维组织，仅有散在的细胞，细胞量太少，细胞培养也未能成功。其余裸鼠肿瘤块获得生长，成瘤率90.9%。接种第2天观察接种点局部隆起较接种当时稍有缩小，此后1周内肿瘤大小无明显变化。第2周开始肉眼可见肿瘤略有增大，此时测量肿瘤大小作为基础值。肿瘤生长缓慢，至第11周，肿瘤直径较第2周增加约1倍(图1)，其平均体积明显大于基础(P＜0.001)，移植瘤表面光滑、活动，与周围组织无粘连。此间裸鼠一般状态良好，于第11周末断头处死裸鼠，解剖后发现移植瘤为有包膜的实体瘤(图2)，病理组织切片证实移植瘤与人脑膜瘤组织学类型一致，染色体检查为亚中着丝点染色体，符合人类体细胞核型；电镜下移植瘤细胞表面有指状突起，细胞间以指状突起相连，并可见特化结构桥粒(图3)。

图1裸鼠移植脑膜瘤生长曲线(以对数表示)

图2第11周裸鼠移植脑膜瘤成瘤情况

图3裸鼠移植脑膜瘤电镜观察

3讨论

由于脑膜瘤术后有复发倾向，探索一种安全有效的辅助疗法一直是神经外科主要研究课题之一，而将人脑膜瘤移植于动物体内，建立脑膜瘤移植模型则是检验各种治疗方法的重要手段。动物体内实验使得肿瘤的生长环境更接近于临床，对肿瘤的发生、发展机制的研究、对肿瘤治疗的探索是极为重要的。为此，一些国外学者进行了建立脑膜瘤移植模型研究，例如Greene最早描述将人脑膜瘤移植到豚鼠眼内^［3］；1977年Rana成功地将人类恶性脑膜瘤移植到裸鼠皮下^［4］。理想的脑膜瘤动物模型应该是：①必须由脑膜瘤细胞组成；②生长速度可以预见并能重复；③品系要小，价格便宜，以便达到一定数量有利于估计治疗效果；④肿瘤形成时间相对较短；⑤肿瘤对治疗反应的模式能够模拟人类脑膜瘤临床治疗过程^［5］。

将脑膜瘤移植到动物颅内最接近脑膜瘤在人体内的环境和临床状况，但是颅内作为移植部位有其缺点：既不能直接观察肿瘤而进行一系列的肿瘤大小的测量，而且操作比较复杂，容易感染。另外由于颅内空间有限使肿瘤生长到一定大小会引起动物神经功能障碍或死亡，因而不能进行长期的研究。将脑膜瘤接种到裸鼠肾包膜下是另一个比较有前途的移植方法^［6］，但这种方法同样不能进行直接测量，操作也比较复杂，容易感染，用手术方法切开测量则会影响肿瘤的生长。而将脑膜瘤接种于裸鼠皮下则不存在上述缺点^［7］，操作方法简单，容易观察肿瘤生长状况。目前国内尚无建立脑膜瘤裸鼠移植模型的报道，我们用脑膜瘤新鲜组织进行裸鼠移植，取得了较好的效果。为了提高移植成功率，我们在接种时选择4周大小的裸鼠，接种前对裸鼠进行γ射线照射，所有裸鼠接种的同时进行脑膜瘤细胞培养，11只裸鼠中有10只成瘤，细胞培养显示脑膜瘤成分较多，很容易培养成功；而未成瘤的脑膜瘤组织细胞培养仅见少量的细胞，多为纤维组织，细胞培养也未能成功。虽然裸鼠的免疫力极其低下，但未完全丧失，脑膜瘤培养细胞接种裸鼠后早期，其本身有部分细胞死亡，只有生长旺盛的细胞才能存活下来继续分裂增殖形成肿瘤，存活细胞也必须达到一定数量才能成瘤。因此脑膜瘤接种裸鼠时取材十分关键，应选择细胞密集的部位进行接种，则成功的机会很大。

为了进一步证实裸鼠移植瘤来源于人脑膜瘤，我们对移植成活的瘤组织进行了染色体和电镜检查。结果表明移植瘤每一瘤细胞同时具有中央、亚中央或近端着丝粒染色体，符合人类染色体形态，而裸鼠体细胞染色体全部为端着丝粒染色体^［8］，与人类完全不同。电镜下观察移植瘤细胞表面有指状突起，细胞间以指状突起相连，并可见特化结构桥粒，这与脑膜瘤的超微结构特征是一致的。

常规裸鼠皮下接种人类肿瘤细胞的生长可分为3个主要时期：①潜伏期：移植后数天～数周，这时大部分细胞死亡，幸存者开始增生；②增殖期：肿瘤持续增大，细胞处于对数生长期；③稳定期：部分瘤细胞出现坏死，其余细胞继续增殖。本实验接种瘤组织和培养细胞成功的裸鼠，在接种第2天接种点局部隆起较接种当时稍有缩小，可能为移植瘤所含水分吸收所致。移植瘤生长的潜伏期约1周左右，第2周开始持续增大，由于是良性肿瘤，生长比较缓慢，至第11周，肿瘤直径增大约1倍左右。

与脑膜瘤体外培养及其他动物模型相比，脑膜瘤移植于裸鼠皮下的优点在于：①客观反映脑膜瘤生物学特性，避免体外培养不足；②能直接观察肿瘤生长情况；③方<