中图分类号：R735.2；Q344.⁺13文献标识码：A文章编号：1009-4571(2000)02-0175-03

1导言

随着细胞生物学、分子生物学理论和技术的发展，对细胞癌变的发生过程有了进一步的认识，揭示细胞内基因结构及表达异常是细胞癌变的根本原因^［1］。近年的研究发现，胃癌的发生和演进涉及多种癌基因和抑癌基因的异常表达。c-met基因过量表达与细胞异形增殖有关，可能是胃粘膜细胞癌变的早期表现之一；ras基因高表达与细胞增殖有关，是细胞增殖活跃的指标；c-erbB-2基因过度表达与胃癌淋巴结和远处转移、腹腔播散及预后较差有关；p53基因的突变和缺失与胃粘膜细胞异常增殖、癌变以及胃癌细胞侵袭和转移有关，可作为判断胃癌恶性表型的重要指标；MTS₁/p16基因的缺失及低表达可能是胃粘膜细胞癌变的晚期表现；nm23基因的缺失与胃癌的侵袭和转移密切相关。越来越多的研究结果表明，胃癌的发生发展是多种基因异常的结果^［1～6］。但由于上述基因都是在其他肿瘤研究中发现并鉴定的，在胃癌细胞中的出现频率不高，不足以阐明胃粘膜细胞癌变过程中基因改变的规律，至今胃癌的分子生物学研究仍未取得突破性进展。因此，直接从胃癌组织中克隆胃粘膜细胞癌变相关基因，有着非常重要的意义。

2目前研究方法的优点与局限性

癌细胞和正常细胞的差别主要在于基因表达的差异，即mRNA的差异。目前，常用于比较基因表达不同的消减杂交法(subtractive hybridization)，虽然方法灵敏，可以检测出微量的mRNA，但重复性差，难以建立，其最大的局限性是每次杂交只能在2个样本中进行单向筛选，这些缺点限制了此方法的实际应用^［7］。1992年，Liang 和 Pardee^［8］建立了一种分离差异表达基因的全新方法——mRNA差异显示技术(differential display)，其基本原理是：以一系列oligo(dT)引物锚定mRNA的polyA尾部，逆转录样品细胞中全部表达的mRNA，通过PCR技术扩增，在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离目的DNA片断，筛选出目的基因。由于变性电泳时常导致电泳后条带模糊，孟祥文等^［9］采用SYBRTM GREENI荧光染料对凝胶直接染色的非变性电泳方法进行mRNA差异显示，从具有不同转移能力的人肺腺癌细胞系中克隆到2个肺腺癌转移相关基因。众多研究显示，采用mRNA差异显示技术从乳腺癌、卵巢癌、皮肤鳞状细胞癌、膀胱癌、胰腺癌及肺癌中均分离到肿瘤相关基因^［10］。mRNA差异显示技术作为分离肿瘤细胞与正常细胞间基因差异的新工具，具有许多优点：①以PCR、DNA测序等分子生物学常用技术为基础；②所需mRNA量仅为1～2μg；③可同时比较多种样品的基因表达差异；④可在2天内获得探针，1周内完成克隆；⑤电泳时，90%～95%的mRNA显示条带具有重复性；⑥实验每一步骤均可检查验证，无需在整个过程结束时才证实实验是否顺利^［10］。mRNA差异显示技术因具上述特点，越来越受肿瘤研究者的重视，该技术发展迅速，应用也日益广泛。

3克隆胃粘膜细胞癌变相关基因的技术路线设计

鉴于胃癌相关基因的研究现状和mRNA差异显示技术的日臻完善，我们拟直接从胃癌、癌旁组织及正常胃粘膜组织细胞中提取总RNA，采用随机引物(Arbitary Primer,AP)-PCR方法^［11］，分三组进行mRNA差异显示，克隆胃粘膜癌变相关基因。直接从组织细胞中提取mRNA，避免了培养的肿瘤细胞系中人为的影响，最真实地反映了细胞中基因表达的状况。

3.1工艺流程

胃癌组织标本的取材→从组织细胞中提取总mRNA→合成cDNA第1链→AP-PCR扩增→非变性凝胶电泳→SYBRTM GREEN I染色显示→差异片段的回收、再扩增及克隆→对克隆作PCR鉴定证实→原位分子杂交进行组织定位→克隆基因片段的测序及同源性比较。

3.2操作步骤

3.2.1样品制备及主要试剂材料选取术前未经化疗和放疗的胃腺癌标本，离体后立即由经验丰富的病理医师取材，三组样品取材的标准：胃癌组织为肿瘤实质无坏死区；癌旁组织为距肿瘤1cm处胃粘膜；正常胃粘膜组织为距肿瘤5cm的远处胃粘膜。取材大小为15mm×3mm×3mm，分作5块，中间1块迅速冷冻，用于提取总RNA；2块固定于10%中性缓冲福尔马林液中，备作病理检查；另2块冷冻保存，以备作原位分子杂交。

主要试剂材料包括RNA提取试剂盒和cDNA第1链合成试剂盒；cDNA第1链合成引物、10mer随机引物、PCR试剂盒和原位分子杂交试剂盒；荧光染料SYBRTM GREEN I；pT7 Blue和DH5a感受态菌。

3.2.2总RNA的提取异硫氰酸胍溶液裂解组织细胞，按RNA提取试剂盒说明进行3组样品总RNA的提取和纯化。

3.2.3cDNA第1链合成以T₁₅G、T₁₅A、T₁₅C为引物，取2.5μg总RNA，按cDNA合成试剂盒说明分别合成3组样品的cDNA第1链。

3.2.4AP-PCR扩增将cDNA第1链合成产物稀释100倍后，取2 μl，以cDNA第1链合成引物和10mer随机引物进行PCR扩增，每一反应总体积为20μl，PCR条件为：①95℃ 3min，40℃ 5min，72℃ 5min；②95℃ 15s，40℃ 2min，72℃ 1min，共25循环；③75℃ 5min。

3.2.5电泳分离差异片段按常规方法配制6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌制胶厚为1.0mm的胶板。取10μl PCR产物，加2μl缓冲液，混匀，加样。以恒电流方式电泳。

3.2.6荧光染料染色终止电泳，取下凝胶，用SYBRTM GREEN I(1∶10000)避光染色5～10min。在紫外线(254nm)检测仪上进行检测、分析及摄影。

3.2.7回收和扩增差异片段根据紫外线下检测情况，切下含差异片段的凝胶回收，重新进行AP-PCR扩增，反应条件同上，纯化扩增产物。

3.2.8克隆目的基因片段及对克隆进行PCR鉴定证实PCR扩增产物与pT7 Blue(克隆位点为EcoRV，3′端加添T)连接。连接反应后，取10ml反应液，DH5α感受态菌100μl，加入到试管内进行转化。取转化液100μl涂布于含Ampicillin和X-gal的LB培养皿上，置37℃，培养14～16h。挑一白色克隆，加40μl LB培养基，混匀。取1 μl进行AP-PCR扩增，反应条件同上。扩增产物作电泳分析，以确定所挑选克隆内是否含有目的基因片段。

3.2.9原位分子杂交以获得的cDNA片段作为探针，采用生物素缺口平移标记，对3组样品的组织切片进行原位分子杂交，以明确所获得的基因长段的细胞定位。

3.2.10克隆基因片段的测序及同源性分析采用DNA自动测序仪，以标准测序条件对纯化后的克隆片段进行DNA序列分析。将测序后的cDNA序列与Gene Bank资料中已知序列进行同源性分析。

4结语

近年来，本课题组承担并完成了关于胃癌和癌前病变中肿瘤相关基因及其产物表达的多项研究课题，深深地认识到直接从胃癌组织中克隆胃粘膜癌变相关基因，在阐明胃癌发生机制及胃癌的早期诊断和临床治疗方面，具有重要价值和广阔的应用前景。胃粘膜细胞癌变相关基因片段的获得，可制成DNA探针，开发胃癌基因诊断试剂盒，应用于胃癌的早期诊断，具有较大的经济效益和社会效益。另外，胃粘膜细胞癌变相关基因的获得在胃癌的基因治疗方面也具有重要意义。

参考文献：

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［3］刘勇，李启明，胡志坤，等.胃粘膜肠化生细胞增殖状态的分型及其临床意义［J］.中华消化内镜杂志，1997，14(6)：359-362.

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［11］孟祥文，李璞.AP-PCR方法及其应用［J］.国外医学遗传学分册，1995，18(3)：117-119.

收稿日期：1999-10-16

修回日期：1999-12-06