【摘要】目的：探讨多肿瘤抑制基因p16蛋白和nm23-H₁基因蛋白在人食管癌的表达及与肿瘤生物学行为的关系。方法：应用免疫组织化学方法观察51例食管鳞状细胞癌及其淋巴结转移癌中p16蛋白的表达，结合观察转移抑制基因nm23-H₁的表达。结果：p16在食管鳞状细胞癌中呈低表达(45.1%，23/51)，阳性率显著低于正常食管粘膜及癌旁组织(P＜0.01)，阳性率与分化程度相关(P＜0.01)，Ⅰ级66.7%(14/21)，Ⅱ级34.8%(8/25)，Ⅲ级14.3%(1/7)；与肿瘤浸润、转移无关。nm23-H₁的阳性率为60.8%(31/51)，与浸润深度呈负相关(P＜0.05)，淋巴结转移癌的阳性率(18.8%，3/16)显著低于食管癌原发灶(P＜0.01)。p16与nm23-H₁的表达无关。结论：p16蛋白在食管癌的低表达提示有频发性的p16基因失活，且与肿瘤分化有关。nm23-H₁与食管癌的浸润，转移相关。p16和nm23-H₁的失活在食管癌的形成及发展中可能起不同的作用。

中图分类号：R735.1；R730.231文献标识码：A

文章编号：1009-4571(2000)01-0010-03

The expression of p16 and nm23-H₁gene protein in esophageal squamous carcinoma and its significance

LIU Li-MingWANG Wan-zhong

（shandong Science and Technology University,Jinan 250021）

【Abstract】Objective：To investigate the expression of multiple tumor suppressor gene (p16)protein and metastasis suppressor gene nm23-H₁ protein in esophageal squmous carcinoma (ESC).Methods：With ABC and LSAB immunohistochemistry,the paraffin embedded tissues of 51 cases of ESC and 16 cases of the lymph node metastatic tumors were stained by using the polyclonal antibody against the human p16 protein and monoclonal antibody against human nm23-H₁ protein.Results：A low expression of p16 protein was showed in this study.The positive rate was 45.1%(23/51) in ESC,and it was significantly lower than that in the normal esophageal membrane and the surrounding tissues (P＜0.01).Significant difference was also found among the high,middle and low differentiated ESC(P＜0.01)，but the expression was not related to the tumor invasion and lymph node involvement.The positive rate of nm23-H₁ in ESC was 60.8%(31/51),and showed a negative relationship with the invasive depth(P＜0.05).Significant difference was also found between the expression of nm23-H₁ in lymph node metastatic lesions and in the primary lesions(P＜0.01).No relationship was found between the expression of p16 protein and nm23-H₁ in all the lesions.Conclusions：The low expression of p16 protein showed a frequent inactivition of p16 gene in ESC,and was related to the differentiation of this tumor.nm23-H₁ was related to the invasion and metastasis of ESC.p16 and nm23-H₁ may play different role in the carcinogenesis and development of ESC.

【Key words】esophageal carcinoma;p16 protein;nm23-H₁ protein;immunohistochemistry

利用硫酸铝钾暴露抗原技术^［1］，观察了51例食管鳞状细胞癌p16蛋白和nm23-H₁基因

产物的表达，结合其他临床病理指标，探讨p16和nm23-H₁蛋白在食管癌发生发展中的作用。

1材料与方法

1.1标本

选用山东省立医院1995年以来手术切除食管鳞状细胞癌标本51例，男性39例，女性12例，年龄38～72岁，平均51.7岁。肿瘤组织学分级：Ⅰ级(高分化)21例，Ⅱ级(中分化)23例，Ⅲ级(低分化)7例。有16例发现食管周围淋巴结转移。本研究对51例原发灶和16例转移灶进行免疫组织化学染色，选用12例非肿瘤病变的食管粘膜活检标本为正常对照，以PBS代替一抗为阴性对照，以已知阳性的乳腺癌标本为阳性对照。标本均常规甲醛固定，石蜡包埋。

1.2染色方法

4 μm连续切片，脱蜡，水化后，硫酸铝钾暴露抗原，分别滴加p16蛋白多克隆抗体(1∶100，Santa Cruz公司)和nm23-H₁单克隆抗体(1∶50，Santa Cruz公司)为一抗，分别以ABC试剂盒(Vector公司)和LSAB试剂盒(Dako公司)进行染色，DAB显色，苏木素复染。

1.3结果判断和统计学分析

当超过10%的细胞呈胞核或胞浆棕黄或棕褐色时，判断为阳性。采用χ²检验分析组间差异及计数资料相关分析。

2结果

2.1p16蛋白的表达状况

p16在正常对照组的阳性率为91.7%(11/12)；在51例原发灶中，阳性23例，阳性率45.1%；癌旁组织的鳞状上皮阳性表达42例，阳性率82.4%，显著高于癌组织(χ²=13.74,P＜0.01)。在各组织学分级中，阳性率分别为：Ⅰ级66.7%(14/21)，Ⅱ级34.8%(8/25)，Ⅲ级14.3%(1/7)，其中Ⅰ级显著高于Ⅲ级(P＜0.05)。阳性率与分级呈负相关(χ²=9.54,P＜0.01)。不同浸润深度，p16阳性率分别为：浅层浸润75.0%(3/4)，肌层浸润66.7%(8/12)，外膜及周围组织浸润34.3%(12/23)，阳性率与浸润深度无关(χ²=5.34，P＞0.05)。16例淋巴结转移灶的p16阳性率为62.5%(10/16)，与其原发灶相比无差异，与未发生转移的35例原发灶相比亦无明显差异，后两者相比差异也无显著性(χ²=0.03，P＞0.05，图1、2)。

2.2nm23-H₁基因产物的表达状况

nm23-H₁在正常对照组的阳性率为91.7%(11/12)；51例肿瘤中阳性31例，阳性率60.8%；癌旁组织阳性率为62.7%(32/51)，与癌组织相比差异无显著性(P＞0.05)。各组织学分级的阳性率分别为Ⅰ级71.4%(15/21)，Ⅱ级56.5%(13/23)，Ⅲ级42.9%(3/7)，差异无显著性。不同浸润深度，nm23-H₁的阳性率分别为：粘膜及粘膜下层浸润100.0%(4/4)，肌层浸润83.3%(10/12)，外膜及周围组织浸润48.6%(17/35)，阳性率与浸润深度呈负相关(χ²=7.29,P＜0.05)。在发生淋巴结转移的16例原发灶中，nm23-H₁阳性率为56.3%(9/16)，与未发生转移的35例原发灶(62.99%，22/35)相比差异无显著性。16例淋巴结转移灶的nm23-H₁阳性率为18.8%(3/16)，显著低于其16例原发灶(χ²=4.8，P＜0.05)和无转移的35例原发灶(χ²=8.55,P＜0.01，图3、4)。

2.3p16和nm23-H₁表达之间的关系

在51例食管癌中，p16和nm23-H₁共同阳性16例，共同阴性13例，分别有7例和15例单独表达p16和nm23-H₁，两者的表达无相关性(χ²=0.67,P＞0.05)。

p16蛋白和nm23-H₁的表达与患者性别、年龄及肿瘤大小均无关系。

图1食管鳞状细胞(Ⅱ级)浸达外膜呈

p16蛋白强阳性(ABC法，×200)

图2食管鳞状细胞癌(Ⅲ级)呈

p16蛋白强阳性(ABC法，×200)

3讨论

p16基因蛋白通过与细胞周期素D₁(cyclin D₁)竞争性结合周期素依赖性蛋白激酶4(CDK4)，抑制其活性，阻滞细胞周期于G₁期，调控细胞分裂^［2］。各种原因引起的p16基因失活均可使p16蛋白的竞争性减弱，cyclin D₁与CDK4的结合增加，CDK4活化，细胞分裂加快，失去控制时则癌变。常见的p16基因失活方式有基因缺失、突变、甲基化等^［3］。分子生物学技术可以检测p16基因变异情况，而采用免疫组织化学方法则可以观察p16基因蛋白的表达状况，间接反映p16基因的变异。如Kratzke^［4］应用免疫组化和分子生物学方法研究恶性间皮瘤，发现在瘤旁组织中有高表达，而在肿瘤中则多为阴性，认为免疫组化可以检测到具有抑癌作用的p16蛋白，而在癌组织中由于有频发的p16变异，p16蛋白减少或缺乏，故免疫组化阴性。有关食管癌p16基因异常的研究已有分子病理学的报道。Liu^［5］发现在食管癌细胞系中有频发的p16缺失。Mori^［6］在研究日本食管癌病例时发现p16总突变率为52%，其中包括8例移码突变，6例错义突变。Okamoto^［7］对中国食管癌病例的研究发现p16变异率不超过10%，认为与患者的遗传、环境因素有关。我们的研究发现，与正常食管粘膜及癌旁组织相比，食管癌中的p16蛋白呈低表达，而且阳性率与肿瘤组织学分级呈负相关，<