【摘要】目的：探讨食管鳞癌组织中新肿瘤抑制基因maspin的变化。方法：采用免疫组化ABC方法测定食管癌高发区食管癌组织中肿瘤抑制基因maspin蛋白的表达状况。结果：食管癌组织中maspin免疫阳性表达率为10%(3/30)，免疫阳性反应主要位于癌组织的细胞浆中。结论：肿瘤抑制基因maspin可能在食管癌变过程中起一定作用。

中图分类号：R735.1；R730.231文献标识码：A

文章编号：1009-4571(2000)01-0013-03

Preliminary study on tumor suppressor gene maspin in esophageal squamous cell carcinomas

LI JianYANG Wan-caiFENG Chang-weiet al

（Department of Gastoenterology,the Second Affiliated Hospital of Henan Medical University,Zhengzhou 450003）

【Abstract】Objective:To investigate the changes of tumor suppressor gene maspin in esophageal squmous carcinoma.Methods:Immunohistochemistry method(ABC) was used to determine the immunoreactivity of maspin in 30 patients with esophageal cancer in a high incidence area for esophageal cancer.Results:The positive immunostaining rate of maspin protein was 10% (3/30) in esophageal cancer,and the immunoreactivity of maspin protein was chiefly located in the cytoplasm of tumor cell.Conclusions:The present results indicated that tumor suppressor gene maspin might play a role in esophageal carcinogenesis.This concept need to be confirmed by further studies.

【Key words】tumor suppressor gene；maspin；esophageal squanous cell carcinoma

1994年，Zou等^［1］用减数杂交技术从人正常乳腺上皮细胞中分离出一种新基因，其编码蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serin protease inhibitor, Serpin)超家族中的一种，该基因被称为maspin基因(mammary serpin)。研究表明，maspin基因表达于人正常乳腺上皮细胞中，但在大多数乳腺癌细胞系中不表达，并且maspin基因在乳腺癌发生过程中起着重要的作用^［2］。但是，maspin与其他肿瘤的关系未见报道。采用免疫组织化学方法检测maspin基因蛋白在食管鳞癌发生中的表达状况，并进一步探讨其在食管鳞癌发生中的作用。

1材料与方法

1.1实验材料

30例食管癌患者均来自食管癌高发区河南省林州市，所有患者术前未经化疗和放疗。男19例，女11例；年龄45～68岁，平均54.6岁。手术切除癌组织常规病理学处理。

1.2实验方法

采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法。抗maspin抗体为兔抗人多克隆抗体(National Cancer Institute惠赠)，2%小牛冻干血清蛋白(BSA)为美国Sigma公司产品。ABC试剂盒和DAB底物试剂盒为美国Vector公司产品。

主要步骤如下^［3～5］：切片脱蜡至水，0.1%H₂O₂室温孵育20 min；正常马血清(1∶50)室温孵育20 min封闭非特异性免疫球蛋白反应；2%BSA稀释一抗maspin 1∶200，4℃孵育12 h；2%BSA稀释生物素标记的二抗1∶200，室温孵育45 min；ABC室温下孵育60 min(使用前30 min新鲜配制)；二氨基联苯胺(DAB)和0.3%H₂O₂混合孵育5～10 min，显微镜下观察。采用生产第二抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应与省略孵育第一抗体作为阴性对照。

1.3结果判定

免疫组化阳性标准和分布类型参考以往文献报道^［3，4］。根据maspin免疫阳性细胞的分布状况，将免疫反应分为弥漫型、局灶型和镶嵌型三种类型。

2结果

30例食管鳞癌中，共检出3例maspin蛋白免疫阳性反应，占10%。maspin蛋白免疫阳性反应主要位于癌细胞浆中，其中2例呈局灶性分布，1例呈弥漫性分布，胞核和间质内均未见阳性反应。

3讨论

1994年，Zou等^［1］用减数杂交技术从人正常乳腺上皮细胞中鉴定出一个编码蛋白为丝氨酸蛋白酶抑制剂的新基因maspin，他发现用maspin基因转染MDA-MB-435乳腺癌细胞，可降低裸鼠肿瘤发生和转移的能力，降低穿透基底膜基质的能力。Sheng等^［2］研究表明，在大肠杆菌(E. coli)和 Spodoptera frugiperda昆虫细胞中纯化提取的rGST-maspin 和rmaspin (i) 两种重组maspin蛋白同样具有抑制肿瘤浸润的能力，因此人们认为 maspin基因是一种新的肿瘤抑制基因^［1，2］。

maspin 基因编码的蛋白是一个分子量为42 kDa的蛋白质，与包括人单-粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，纤溶酶原激活因子Ⅰ、Ⅱ等在内的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的部分成员序列同源^［6］。从人正常乳腺上皮细胞分离出来的maspin 互补DNA(cDNA)含有2 584个核苷酸，其中5′端核苷酸75个，无转录功能的3′端核苷酸1 381个，编码375个氨基酸的蛋白。包括一个与胺基结合的终末蛋氨酸和一个与羧基结合的终末缬氨酸。其内部尚有8个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基形成2个或2个以上的二硫键，对maspin 蛋白的特异三维结构具有稳定作用^［1］。由于该蛋白具有稳定的三级结构，因此可通过免疫组化的方法检测出来。

Pemberton等^［7］研究表明，maspin 或maspin样蛋白分布于人体许多器官，是与分泌囊泡有关的可溶性胞浆蛋白，表达于细胞表面，作者认为这种亚细胞定位研究表明 maspin蛋白可能在细胞迁移、运动和增殖中起重要作用。Sheng等^［8］研究提示，maspin反应位点与单链组织纤溶酶原激活因子(sctPA)相互作用形成稳定的重组maspin蛋白，该蛋白的重要效应是通过sctPA激活纤溶酶原的活性，并认为组织纤溶酶原激活因子是maspin的作用靶子。国内邵志敏等^［9］对maspin的研究表明，乳腺肌上皮细胞分泌大量的maspin蛋白，去除maspin蛋白后的人类肌上皮细胞HMS-1 CM 不再具有抑制乳腺癌细胞体外浸润的能力，提示maspin蛋白在乳腺肌上皮细胞抑制乳腺癌细胞体外浸润能力方面起重要作用。

尽管maspin与乳腺癌、前列腺癌等腺癌的关系密切^［2］，但与其他肿瘤(特别是鳞癌)的相关性研究尚未见报道。本研究结果显示，食管癌高发区居民食管鳞癌终末阶段存在maspin阳性表达，提示在其癌变过程中可能发生了maspin结构改变、功能异常，从而导致其蛋白表达缺失。研究还发现，食管鳞癌组织中maspin蛋白免疫阳性反应主要定位于细胞浆，这与p53和cyclin D₁蛋白等细胞周期蛋白的定位不尽一致(食管鳞癌组织中p53和cyclin D₁蛋白阳性表达主要位于细胞核^［3］)，结合上述文献^［7～9］，提示maspin在不同来源的肿瘤组织中作用的途径不同，而且与p53和cyclin D₁等细胞周期蛋白的致癌机制不尽相同，这一概念尚需更多的实验研究来证明。

研究表明，食管癌变过程是多阶段、进行性发展的过程^{［3～5，10］}，而且在食管癌变过程中已发现有多种基因的变化，如肿瘤抑制基因p53、Rb、p16的突变和蛋白聚积以及癌基因ras、Cyclin D₁的活化等^［5，10］。在癌变不同阶段可能有不同的基因和分子学变化参与，这些不同的分子学变化的综合作用，可能是导致食管上皮恶性转变并持续发展的主要因素^［10］。尽管maspin基因变化在食管癌变中的意义尚不清楚，但是进一步了解maspin基因与其他肿瘤抑制基因和癌基因在食管癌变过程中的变化关系，不仅有助于了解肿瘤抑制基因maspin变化的生物学意义，而且有助于加深对食管上皮癌变的分子生物学变化基础的认识。

参考文献：

［1］Zou ZJ,Anisowicz A,Hendrix MJC,et al.Maspin,a serpin with tumor suppressing activity in human mammary epithelial cells ［J］.Sciencs,1994,263:526-528.

［2］Sager R,Sheng S,Pemberton P,et al.maspin.A tumor suppressing serin ［J］.Adv Exp Med Biol,1997,425:77-88.

［3］Wang LD,Stephanie TS,Zhou Q,et al.Changes in p53 and cyclin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human esophagal and gastric-cardia carcinogensis ［J］.Int J Cancer,1994,59:514-519.

［4］Wang LD,Zhou Q,Hong JY,et al.p53 protein accumlation and gece mutationsin multfocal esophageal precanceous lesions from symptom free subyects in a high incidence area for esophageal carcinoma in Henan,China ［J］.Cancer,1996,77:1244-1248.

［5］李健，赵治国，周琦，等.ras蛋白在食管癌及食管癌前病变组织中的表达［J］.中国肿瘤临床与康复，1999，6(1)，11-12.

［6］Sheng S,Pemberton PA,Sager R.Production,purification and characterization of recombinaant maspin protein ［J］.J Biol Chem,1994,266,15240-15243.