中图分类号：R730.51文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)06-0453-04

对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。80年代，有人将一些毒素蛋白偶联到与肿瘤细胞有亲和结合的抗体上，产生了第一代的免疫毒素(Immunotoxin)。免疫毒素的免疫原性和毒性，推动了免疫毒素从两个方面进行改造：弹头和毒素。弹头主要是抗体，包括肿瘤细胞表面过度表达的生长因子受体的配体。由于近年基因技术的突破，免疫毒素在肿瘤治疗领域展现了美好的前景。

一、对抗体的研究

近年来PCR技术的发展大大简化了获取抗体可变区基因的过程，用5′端前导顺序或框架区引物及3′端恒定区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到抗体的可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达载体上。通常针对不同的V_H和V_L家族采用不同的引物。

1.单链抗体

Fv片段是指成对的V_H和V_L构域。人工表达的Fv片段还保留原有的抗原结合能力^［1］，但V_H和V_L仅由相对较弱的非极性键连在一起，因此在低浓度时有些Fv片段就解离了。进一步的改进就是将V_H和V_L用一个小肽(Linker)连起来，即单链抗体(Single Chain Fv,scFv)^［2］。

单链抗体的关键是Linker序列，Linker必须能使轻、重链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。同时，Linker尽可能减少受到蛋白酶的攻击，并防止单链抗体的聚集。Linker长度以14～25个氨基酸残基为适，目前最常用的Linker序列是由Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构和计算机辅助分析结果设计的，具刚性结构的15肽序列(Gly₄Ser)₃。

单链抗体保留了原有单价F_ab的抗原结合能力。由于分子量比较小(25 kD)，有利于穿过血管组织定位于肿瘤，但是许多抗原抗体的相互作用涉及结合部位，从而限制了单价scFv的应用。进一步改进是将两个scFv联在一起组成双scFv片段以增加其亲和力。

2.dsFv和pFv

尽管scFv能满足大部分Fv的稳定性，有时scFv单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，Linker结构会破坏scFc的正确重叠。因此，在scFv基础上又增添了两种形式disulfide stabilize Fvs(dsFvs)、permutated Fvs (pFvs)。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及α-螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体分子(dsFv)。dsFv在37℃很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性^［3］。动物实验也证明dsFv疗效优于scFv。V_H和V_L的三维图象显示CDRs(Complementarity Determining Regions)在分子顶部，3-3b的β折叠区(base loops)位于分子的底部，将V_H和V_L各自base loops切开、交叉连接，也就构成了更为稳定的pFv^［4］。anti-Tac pFv与anti-Tac scFv有相似的结合活性和全部的特异性，稳定性更强，在人血清中37℃ 24 h后仍能维持25%的结合活性。

3.具有完整抗体结构的人-鼠工程抗体

(1)嵌合抗体(Chimeric Antibody)：嵌合抗体的C区是人源的，同时具有抗原结合能力以及Fc的效应，可以根据所要求的抗体效应功能选择人重链各亚类的C区基因。对用于杀伤细胞的抗体通常选用IgG1的C区，因为其Fc能够结合巨噬细胞、多形核白细胞等的Fc受体上，包括FcR1、FcR2、FcR3，从而介导ADCC和补体激活的杀伤效应，例如人-鼠IgG1嵌合抗体已被证明能介导针对肿瘤细胞的单核细胞和淋巴细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒性^［5］。如抗体仅用于激活等，则通常采用人IgG2或IgG4的C区。

(2)重构抗体(Reshaped Antibody)：将特异抗体的CDRs移植到另一个抗体的可变区框架上，这种仅拥有鼠源CDRs的人抗体分子几乎可以说是人源的，称人化抗体(Humanized Antibody)^［6］。框架区的某些氨基酸也参与了CDRs环的组成，因此一种是根据已知的人抗体序列，选取与供体鼠抗体框架区同源性最高的人抗体分子作构建重构抗体的基础。V_H和V_L的框架区不必来源于同一抗体分子。另一种是根据已知的X光衍射结构选取人的框架区，再根据植入特异抗体CDRs的结构来修饰人供体的框架区。

4.人源抗体、抗体库、分泌人抗体的小鼠

抗体库(Antibody Library)^［7］基本原理就是将各种B细胞的轻、重链V基因分离出来组成轻、重链V基因库，通过随机配对组装入载体，从而组成巨大的抗体组合基因文库(Recombinatorial Antibody Gene Library)。但是，体内抗体与抗原的结合力是在逐次免疫后提高的，即亲和力成熟现象(Affinity Maturation)^［8］。在生发中心，经抗原刺激后的B细胞，其抗体V基因发生大量体细胞突变(Somatic mutation)，结合抗原筛选和细胞凋亡的机制，从中选择出能生成抗原特异的高亲和力抗体的B细胞。在人体就要考虑定点突变的方式。

如果将人免疫球蛋白基因组替代小鼠的，并进行正常的B细胞发育，包括重排，则在免疫后能诱发V基因的高突变，选择并扩增产生高亲和力抗体的B细胞，那将得到有特异结合能力和各种效应的完整人单抗^［9］。

上述各种基因工程抗体，目的是有较强的亲和性，尽量少的鼠源性。应用基因工程技术改造现有的具有优良特异性和亲和力的鼠类抗体，仍是现有最实际的方法，有很多已进入临床使用。

作为免疫毒素的靶子须有下列条件，第一是肿瘤抗原的特异性，最理想是肿瘤的特异抗原，进而制备抗体，但目前大多数是肿瘤相关抗原，具有相对特异性，属于胚胎性抗原较多；另一类是生长因子受体，如EGF、IL-2的受体在某些肿瘤细胞过度表达^{［10，11］}。其二是靶抗原不能以脱落形式存在，主要存在于细胞表面，以免可溶性抗原与免疫毒素竞争结合。其三，抗原抗体结合后抗原能够被“内吞”，使毒素分子转运入细胞内，产生杀伤作用^［12］，符合这三个条件，才能成为免疫毒素的靶子。

某些生长因子受体在肿瘤细胞表面过度表达，其配体可发挥类似抗体的功能。EGF受体的配体TGF-α与PE40、PE38构成的免疫毒素对肿瘤细胞有明显的特异杀伤活性，TGF-α-PE38抑制非小细胞肺癌(NSCLC)克隆形成的LD₅₀为0.002～0.1 ng/ml^［13］。

二、对毒素的研究

1.超抗原(Superantigen)直接与MHC-Ⅱ类分子结合形成配体，通过该配体与T细胞受体(TCR)的Vβ结合来激活T细胞的抗原分子，具有极高的T细胞激活频率，与基因工程抗体融合后不再依赖MHC-Ⅱ类分子，可发挥强有力的细胞毒活性，超抗原的研究对象目前主要是葡萄球菌肠毒素(SEA)。在鼠体内取得了疗效^［14］。

2.核糖体延伸因子-2抑制剂：1.植物类核糖体失活蛋白(RIPs)，阻断28s rRNA的4324位腺嘌呤的N糖苷键。又分为两型，Ⅰ型RIPSs如BD1只有酶活性结构，没有结合区。从葫芦科植物Bryonia泻根提取的BD1，其重组合成肽为267个氨基酸。Francisco JA用烟草细胞表达系统不仅表达成功有活性BD1，而且成功表达有特异结合活性和杀伤活性的融合蛋白抗体ntBD1-G28-5 scFv^［15］。Ⅱ型RIPs包括蓖麻毒蛋白(Ricin)，即有酶活性区，又有结合区。Ricin的A链结合的anti-CD7-dgA治疗T细胞淋巴瘤和白血病患者，最大的耐受剂量MTD每天达0.2 mg/kg^［16］。2.细菌毒素类，包括：①白喉毒素及衍生物(Diphtheria toxin,DT)^［17］DT分子量60 kD,A链发挥酶活性，B区具有细胞结合活性，结合活性主要在羧基末端；同时有介导A区内吞转移的作用。将B区去除或点突变，可以制备一系列DT衍生物，去除了正常细胞的结合活性，保留了转位和ADP核糖基化活性。这类DT非常特异，对正常细胞低毒。②绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)^［18］PE是66 kD的单链蛋白，氨基末端1-252个氨基酸构成Ⅰa区，为细胞结合结构域。Ⅰ_b 365～404，是介于Ⅱ与Ⅲ区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不影响毒素活性。第253～264氨基酸组成Ⅱ区，负责毒素的转位。Ⅲ区，405～613，具有ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解酶的作用下，Ⅰ、Ⅱ区被去除，Ⅲ区转移入内质网，再转移至胞质。

将PE分子的Ⅰa去除，则产生了PE40，用PE40和其它一些配体，如生长因子或抗体相连接，即重组免疫毒素，能够强烈杀伤受体细胞。然而此类免疫毒素在使用过程中，有体内半衰期短，实体瘤穿透率低，及免疫毒素本身的毒副作用，因此，试图通过PE分子的突变来得到改善。目前有以下几种突变体^［19］：(1)PE38，是在PE40基础上进一步除去非特异结构域(第365～380)氨基酸，减少了PE分子上的一个二硫键。(2)PE38 KDEL，是将PE分子的羧基端REDLK置换成KDEL，其活性可提高6～10倍。(3)PE35，其转化结构域上的部分氨基酸进一步被去除(253-279位)，使得分子中的二硫键均被删除，而活性不受影响。通过45例应用PE38免疫毒素临床观察，所产生抗体的主要抗原表位位于PE分子中的274-283、470-492、531-540、555-564、596-609，这将有利于对PE38的基因改造，降低免疫原性^［20］。

荷瘤裸鼠实验表明，免疫毒素的疗效与使用方法有关，隔两天注射共5次最为有效。在SCID(Severe combined immunodeficient)鼠<