摘要：目的分析非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)病人肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因的克隆性增殖及分布情况。方法肺腺癌病人1例，术中取新鲜肺癌组织，肺癌组织经处理后分别与自身肿瘤细胞共同培养3.5天和7天。10例健康人、T细胞株Jurkat和B细胞株Raji作为对照。标本共16份，提取mRNA后经反转录多聚酶链反应(RT-PCR)，PCR产物进一步经基因扫描分析Vβ24个亚家族基因的互补决定区3(CDR3)以确定T细胞克隆性。结果NSCLC病人外周血T细胞仅表达16个Vβ亚家族，Vβ6和Vβ17呈寡克隆。新鲜肺癌组织TIL仅检测到Vβ19表达，呈寡克隆；培养7天后，检测7个Vβ亚家族表达，Vβ8和Vβ16呈寡克隆。10例正常人T细胞表达所有24个Vβ亚家族且均呈多克隆性分布。结论NSCLC病人TIL中，TCR Vβ24个亚家族存在倾斜性分布，T细胞存在克隆性增殖。这可能是肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAA)刺激引起的特异性T细胞免疫反应。研究结果提示，构成经培养的TIL的主要T细胞成分是克隆性增殖的表达有限几个TCR Vβ亚家族的T细胞，这些克隆性增殖T细胞可能是TIL对自身肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的效应细胞。

中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)06-0396-05

THE FEATURE OF CLONAL EXPANSION AND DISTRIBUTION OF TCR Vβ T CELLS OF CULTURED NSCLC TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES

YANG Xue-ningWU Yi-longLI Jin-tian

Lung Cancer Research Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou,510060,China

Abstract：ObjectiveTo study the distribution of TCRVβ subfamilies and clonal expansion of peripheral blood lymphocytes (PBL) and tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients.MethodsFresh NSCLC tumor samples were collected soon after the resection, and the TILs were cultured for 0,3.5,7 days respectively. PBL collected before operation. The complementarity determine region 3 (CDR3) of 24 TCRVβ subfamilies genes were amplified by RT-PCR, the PCR products were further analyzed by Genescan to identify the clonality of the T cells.ResultsPBL expressed 16 TCRVβ subfamilies, Vβ6 and Vβ17 were oligoclonal. Fresh TIL expressed 1 TCRVβ subfamily, Vβ19 was oligoclonal. TIL cultured 3.5 days expressed 5 TCRVβ subfamilies, Vβ5 was biclonal, Vβ16 was oligoclonal. TIL cultured 7 days expressed 7 TCRVβ subfamilies, Vβ8 and Vβ16 were oligoclonal. All 24 TCRVβ subfamilies were expressed and polyclonal in normal control.ConclusionThe skew distribution and clonal expansion of TCRVβ subfamily T cells were detected in PBL and cultured NSCLC TILs. It may be the T cell clones for specific immune response due to tumor-associated-antigens(TAA). The present result showed that the cultured TIL mainly consists of a few TCRVβ subfamily clonal expanded T cell subsets. It suggests that these clonal expansion T cells are potentially specific cytotoxic to autologous tumor cells.

Key words：Lung neoplasms;T cell receptor β；T lymphocyte subsets;cells,cultured

在实体瘤中，常有大量淋巴细胞浸润原发肿瘤部位。这些聚集于肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)的数量与病人的预后有明显的关系，浸润程度愈高预后愈好，可作为预后指标^［1］。TIL被认为代表了机体对肿瘤的特异性免疫反应。研究表明，TIL中存在克隆性增殖T细胞^［2—5］，这可能是机体针对肿瘤相关抗原(tumor associated antigens, TAA)的一种反应。利用T细胞受体(T cell receptor,TCR)基因重排时其互补决定区3(Complementarity dertermining region, CDR3)的高度多样性和Vβ基因24个亚家族的特点，应用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和基因扫描分析(genescan)的方法检测T细胞Vβ亚家族分布及其克隆性(clonality)是近年国外新开展的研究肿瘤免疫的方法^［6］。本研究利用该方法分析1例非小细胞肺癌(NSCLC)病人外周血和与自身肿瘤细胞共同培养的TIL中TCRVβ T细胞的分布及其克隆性。

材料与方法

一、标本标本共16份：经病理证实的NSCLC病人1例，病理学分型为腺癌。术前取病人外周血10 ml，手术切除肺叶后立即取新鲜肺癌组织。10例健康人外周血为正常对照，T细胞株Jurkat作为单克隆对照，B细胞株Raji为阴性对照。

二、肺癌组织TIL的培养取0.1g肺癌组织剪成细小组织块后，加入10 ml完全RPMI-1640培养体系中培养，其中含IL-2 500 U/ml，10 %小牛血清，青、链霉素各200 U/ml，于5 % CO₂ 37 ℃，饱和湿度中分别培养3.5天和7天。

三、RNA提取和反转录合成cDNA外周血单个核细胞分离按常规方法进行。新鲜肺癌组织经研磨后行RNA提取。经培养的TIL收集后即可用于RNA提取。RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco,BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript Ⅱ, Gibco,BRL)反转录合成cDNA第一链，均按常规方法进行。

四、反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)据已报道的24个Vβ亚家族基因分别设计上游引物Vβ1-Vβ24 24个Vβ引物，在Cβ区设下游引物一个^［3］。引物的核苷酸序列见吴一龙等^［2］报道。在Cβ引物内侧设一荧光素标记的Cβ-Fam引物(5′-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG)^［3］，作为基因扫描分析之用。引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。PCR操作按已报道的方法进行^［3］，作为基因扫描分析之用。引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。PCR操作按已报道的方法进行^［3］。总体积为25 μl，其中含1 μl cDNA，0.1 mmol/L dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP)，引物浓度为0.5 μmol/L(任一Vβ引物和Cβ引物)，125U Taq聚合酶，反应在PCR缓冲液中进和［10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 5 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂及0.001%(W/V)明胶］，所有试剂均为Perkin Elmer公司产品。反应共进行40循环，变性温度为94 ℃，1 min(末次10 min)。结束后于4 ℃保存。各反应均设阳性和阴性对照。PCR产物于2.5 %琼脂糖(溴化乙锭染色)凝胶中分析结果。

五、T细胞克隆性分析(CDR3长度分析)

1.标记PCR产物(run off reaction)

RT-PCR产物经电泳分析出现阳性带者进一步经荧光素标记的下游引物Cβ-Fam进行不对称PCR扩增，以得到荧光素标记的单链PCR产物^［3］。反应体系总体积为10 μl，含2 μl未标记PCR产物，0.1 μmol/L Cβ-Fam，3 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，0.25 U Taq聚合酶，共进行35循环，退火温度为66 ℃，余同上^［3］。

2.基因扫描(Genescan)分析(CDR3长度分析)及结果判定

取荧光素Fam标记的PCR产物1 μl，加入2.5 μl甲酰胺、0.5 μl(Genescan-500-Tamra分子量标准品(ABI，Perkin Elmer公司)和0.5 μl加样缓冲液(Genescan-500-Tamra试剂盒，含葡聚糖蓝50 mg/ml，EDTA 25 mmol/L)，于94 ℃变性4 min后于6 %聚丙酰胺凝胶，自动序列分析仪ABI 377 DNA序列分析仪(ABI，Perkin Elmer公司)中电泳，收集资料。具体操作步骤按使用指南进行。通过分析仪中的基因扫描分析软件672对计算机收集的结果进行分析。据电泳过程中不同时间所出现的不同强度、不同颜色的荧光素，相应地显示出不同位置、高度、颜色和形状的峰。峰的位置表示产物的大小(与标准品比较可知确切的碱基对数)，峰的高度表示产物的量，峰的形态表示产物的均一性。如果产物中所含的DNA片段大小完全相同，基因扫描分析显示为单一峰；如果绝大多数DNA片段大小相同，则显示为一主峰及个别极低的小峰；如果产物中DNA片段参差不齐，则呈多峰图像；三者分别提示PCR产物来自单克隆(monoclonal)、寡克隆(oligoclonal)和多克隆(polyclonal)的T细胞^［2］。

结果

一、TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况10例正常人外周血单个核细胞表达所有24个Vβ亚家族。NSCLC病人外周血T细胞表达16个Vβ亚家族。未经培养的新鲜肺癌TIL仅表达Vβ19亚家族；与自身肿瘤细胞共同培养3.5天的TIL表达5个Vβ亚家族；培养7天的TIL表达7个Vβ亚家族。单克隆对照T细胞株Jurkat仅表达Vβ8。阴性对照B细胞株Raji则不表达任何Vβ亚家族(见表1)。

二、T细胞克隆性分析结果对发现阳性带的产物均进行基因扫描分析。结果：NSCLC病人外周血中Vβ6和Vβ17亚家族PCR产物呈一主峰图象(寡克隆)，提示产物大小绝大部分相同，即绝大多数的CDR3长度相同，其余表达的Vβ亚家族均呈多峰图象(多克隆)(见图1)；未经培养的新鲜肺癌TIL中Vβ19呈寡克隆(见图2)；与自身肿瘤细胞共同培养3.5天的TIL中，Vβ5呈双峰图象(双克隆)，Vβ16呈寡克隆，余呈多克隆(见图3)；培养7天的TIL中，Vβ14呈双克隆，Vβ8和Vβ16呈寡克隆，余呈多克隆(见图4)；T细胞株Jarkat Vβ8 PCR产物呈单峰图象(单克隆)；