摘要：目的探讨端粒酶抑制剂作为肿瘤治疗药物的可行性。方法选择人结肠癌细胞株HC8693、人肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株L7402作为靶细胞，观察3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(AZT)和人端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸(S-Oligos)对上述几种肿瘤细胞株的作用，用MTT试验测定细胞毒作用；³H-TdR掺入试验测定细胞增殖速度；用端粒重复序列扩增法(TRAP)半定量方法测定细胞染毒前后端粒酶活性的变化。结果反义核苷酸片段和AZT在一定剂量范围内有抑制肿瘤细胞株繁殖的作用，在抑制细胞生长的同时，端粒酶活性降低，去除抑制剂24 h后，端粒酶活性仍然维持在较低水平。三种细胞中，HC8693和L7402对两种抑制剂较A549细胞株更加敏感，两种抑制剂联合应用比单独应用的效果好。结论AZT和S-Oligos单独或联合应用在体外有抗肿瘤细胞的作用，进一步深入的研究有助于新的抗癌药物的开发。

中图分类号：R73-361文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)06-0415-04

STUDY ON TUMOR CELL LINES AND THEIR TELOMERASE ACTIVITY BY TELOMERASE INHIBITORS

CHEN WenZHANG QiaoWAN De-sen

Department of Health Toxicology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China

Abstract：ObjectiveTo study the potential anti-tumor effect of telomerase inhibitors. MethodsHuman colon cancer cell line HC8693, human lung cancer cell line A549, and human liver cancer cell line L7402 were used as target cells. The effects of 3′-azido-3′-deoxythymidine (AZT) and human antisense phosphorothioate deoxynucleotides (S-Oligos) aganist telomerase template on these cell lines were investigated. The cytotoxic effect of AZT and S-Oligos on tumor cells was quantified by using MTT colorimetric assay. Assay of ³H-TdR incorporation was undertaken to measure the cell replication. The changes of telomerase activity after treatment was detected and quantified by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) semi-quantitative analysis.ResultsBoth AZT and S-Oligos inhibited the growth of three tumor cell lines in a certain range of concentrations, meanwhile the telomerase activity was reduced after treatment. Moreover, 24 hours after removing AZT and S-Oligos from the media, the telomerase activity still maintain at the low level compared to control group. Among these three cell lines, HC8693 and L7402 were more sensitive to AZT and S-Oligos. Combined effect of AZT and S-Oligos was much stronger than either of the two reagents alone. ConclusionThe results indicated that AZT and S-Oligos could be potentially used, alone or in combination, as anti-colon cancer,anti-liver cancer and anti-lung cancer agents or as an auxiliary in cancer treatment.

Key words：Telomerase;Tumor cell,cultured;Oligonucleotides antisense；3′-azido-3′-deoxythymidine/drug effects

正常人体细胞经过一定数目的分裂后，端粒逐渐缩短，最后进入一种不分裂状态，也称衰老(senescence)状态。端粒酶是一种反转录酶，它用自身模板合成端粒重复序列(TTAGGG)_n，使端粒维持一定的长度，细胞可以继续分裂下去。大量的研究发现肿瘤细胞株及肿瘤组织中端粒酶阳性的比率高达70%～100%^［1］。端粒酶作为恶性肿瘤的标记物的观点已被人们普遍接受，目前人们最感兴趣的是端粒酶抑制剂是否可作为抗肿瘤的药物。反义基因片段在临床上已作为肿瘤基因治疗的方法之一^［2］，AZT是一种反转录酶抑制剂，国外有关AZT对爱滋病的治疗作用的研究已有许多的报道^［3］，但对肿瘤细胞的作用少有报道。本实验用两种端粒酶抑制剂：端粒酶模板区硫代型反义寡核苷酸片段和AZT作用于三种肿瘤细胞株，观察它们对肿瘤细胞生长的作用及端粒酶活性的变化，为端粒酶抑制剂的临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、材料

1.试剂3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷(3′-Azido-3′-deoxythymidine,AZT)和四甲基偶氮唑盐(3-［4，5-dimethylthiazol-2yl］-2，5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)从Sigma公司购得；Taq DNA聚合酶从基因公司购得；［5，5′-³H］-dCTP(92.5 GBq/L，比活性2.0 TBq/mmol)是NEN^TM Life Science Products公司的产品；³H-TdR(37GBq/L，比活性13.3 GBq/mmol)是中国原子能科学研究所的产品；人端粒酶模板区的反义寡核苷酸序列为5′-GTTAGGGTTAG-3′，硫代修饰，由上海中科院细胞生物学研究所合成。

2.细胞来源人肺癌肿瘤细胞株A549和人肝癌肿瘤细胞株L7402由广州医学院化学致癌研究所赠给，人结肠癌细胞株HC8693由中山医科大学肿瘤医院腹外科赠给。所有的细胞株都培养在含青链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，传代后48 h开始给试验样品。

二、方法

1.³H-TdR掺入试验三种肿瘤细胞分别接种在24孔培养板中，细胞接种密度为1×10⁵/ml，每组设三个平行孔，实验重复三次。细胞染毒后，在收集细胞的前3 h，向各组细胞的培养液中加入³H-TdR(37kBq/ml)，温育3 h后，用常规方法将细胞消化下来，离心收集细胞，再用100 μl蒸馏水溶解，取20 μl滴在玻璃滤纸上，分别用蒸馏水、5%三氯醋酸及无水乙醇洗玻璃滤纸数次，50 ℃烘干2 h后放入闪烁液中测定同位素标记量。

2.细胞毒性试验(MTT法)细胞接种密度及分组同上。细胞加试品后，在各时间点吸去培养液，加入含0.5 mg MTT/ml的培养液，置37 ℃作用4 h后，去掉培养液，加入少量溶剂DMSO，在摇床上缓慢显色至出现蓝紫色，把适量的DMSO转入标准的96孔比色板，用MB-Ⅲ型酶标检测仪(北京市新技术应用研究所)，波长为570 nm测定OD值。

3.蛋白提取和蛋白浓度测定细胞蛋白的提取按Kim等^［4］的方法进行。蛋白质浓度测定用考马斯亮蓝G-250染色法。

4.端粒酶活性半定量测定用Kim等^［5］改进了的TRAP法进行端粒酶活性的测定，在PCR反应中每个样本加入148 kBq的³H-dCTP，引物序列为TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′及ACX：5′-GCGCGG［CTTACC］₃CTAACC-3′，不同于Kim在1994年建立的TRAP法，这对引物可以在反应前同时加入。PCR的扩增产物用12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用硝酸银染色后，把各样本对应的条带剪下，放入液闪瓶中，50℃烘干2 h后加入闪烁液并测定同位素标记量，每次PCR反应均设阳性对照(鼻咽癌细胞株CNE₂蛋白提取液)和空白阴性对照(裂解液)，为了平衡不同批次之间样本值的差异，每个样本的cpm值都乘以一个校正系数，校正系数=所有批次阳性细胞cpm值的平均数/(样本所在批次阳性细胞cpm值-空白阴性对照cpm值)。

5.统计学分析：统计学上用SSPS软件中的T-test检验来分析。

结果

一、细胞毒性试验(MTT法)AZT及S-Oligos对三种肿瘤细胞株A549、L7402及HC8693都有不同程度的毒性作用，把对照组细胞的OD₅₇₀值作为100%，其它剂量组的OD₅₇₀值与之相比，得到各剂量组细胞相对存活率，AZT对L7402、HC8693和A549三种细胞的半数致死浓度(IC₅₀)分别为2.55 mmol/L、2.03 mmol/L及3.78 mmol/L。S-Oligos浓度为30 μmol/L时，上述三种细胞的死亡率分别为16.8 %、10.33 %和12.9 %，说明在本实验条件下，S-Oligos对细胞的毒性作用较弱。AZT(1.0 mmol/L)及S-Oligos(10 μmol/L)联合作用时，上述三种细胞的死亡率分别为33.2%、38.9%和22.4%。

二、影响细胞生长增殖的作用(³H-TdR掺入试验)结果见图1a和图1b，从图1a可看出染毒两天后，不同浓度的AZT对三种细胞的生长增殖都有很强的抑制作用，且存在剂量-反应关系。在最低浓度组(0.5 mmol/L)，L7402、HC8693及A549细胞株的细胞增殖率分别是对照组的55.8%，53.9%及50.8%，随着浓度的增加，抑制作用也增加，三株细胞中，AZT对L7402和HC8693的抑制作用比A549强。同样地，S-Oligos对细胞增殖也有抑制作用，S-Oligos在浓度为20 μmol/L时，对L7402、HC8693和A549细胞的增殖抑制率分别为58.8%、52.2%及32.0%，说明S-Oligos抑制L7402和HC8693细胞增殖作用较A549强。

图1a叠氮脱氧胸腺核苷对L7402、HC8693和A549细胞生长的抑制作用

三、端粒酶活性的改变(TRAP半定量法)表1显示了AZT和S-Oligos处理三株肿瘤细胞两天后及去除AZT和S-Oligos，继续培养1天后，端粒酶活性的变化。图1a和1b中的%是以对照组的端粒酶活性(cpm)为100%，处理组的cpm与对照组cpm相比得到的端粒酶活性的相对百分比。可见AZT在浓度为2.0 mmol/L时，可使三种肿瘤细胞株的端粒酶活性降低50%左右；S-Olig