摘要：目的研究丁酸类衍生物联合维甲酸对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者原代培养细胞的诱导分化作用。方法采集28例APL患者骨髓单个核细胞体外培养，将各种诱导剂稀释后加入培养体系达到所需的效应浓度，台盼兰拒染率判断细胞存活率，离心甩片制片瑞氏染色后光镜下观察细胞形态，检测NBT还原率及CD11b评价细胞分化程度。结果各组诱导剂对细胞存活力与对照组之间无明显差异，加入ATRA、BA/ATRA、TB/ATRA组，细胞形态向终末期分化成熟、NBT还原率、CD11b表达升高，以BA/ATRA、TB/ATRA组成熟细胞所占比例、NBT还原率高于单用ATRA组，而且ATRA用量减少至单用时的10%。结论丁酸类衍生物联合维甲酸对APL细胞具有协同诱导分化作用。

中图分类号：Q254文献标识码：A

文章编号：1000-7431(2000)05-0322-03

INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF PRIMARILY CULTURED CELLS FROM PATIENTS WITH APL BY BUTYRIC ACID AND ITS DERIVATIVE IN COMBINATION WITH ATRA

CHOU Hui-ying,CHEN Zi-xing，WANG Wei, et al.

(The First Hospital of Suzhou Medical College, Jiangsu Institute of Hematology, Suzhou 215006,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of butyric acid (BA) and its derivative tributyrin (TB) in combination with all-trans retinoic acid (ATRA) on differentiation induction of APL cells. MethodsBone marrow cells were obtained from twenty-eight APL patients, different inducers were diluted to the desired concentration before added to the cultured cells. Cell viability was assessed by trypan blue exclusion and cell morphology was examined under light microscope on cytospin slides stained with Wright's. Differentiation was measured by the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) and the expression of CD11b.ResultsAll inducers had no influence on cell viability. APL cells can be induced by ATRA、BA/ATRA and TB/ATRA to mature stages. NBT reduction and CD11b expression in groups of BA/ATRA、TB/ATRA were higher than that of ATRA alone and the concentration of ATRA needed in the combination was reduced to 10%. ConclusionThe combination of ATRA with BA and its derivative TB synergistically induced differentiation of APL cells.

Key words：Butyric acid (BA) and its derivative;All-trans retinoic acid;Leukemia, promyelocytic,acute;Cell differentiation

全反式维甲酸(ATRA)对急性早幼粒细胞白血病(APL)成功的诱导分化治疗，推动了诱导分化疗法的临床和实验室研究的进展。在此基础上，作者探索了丁酸类衍生物联合ATRA对APL原代培养细胞的体外诱导分化，现报道如下。

材料与方法

一、标本来源我院门诊及住院收治的患者28例，均经骨髓形态学及组化染色检查诊断，其中23例同时进行了细胞遗传学及RT-PCR对PML-RARα融合基因检测。取肝素抗凝骨髓，以比重1.077的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，以(2.0～10.0)×10⁵/ml细胞浓度接种于含10 %小牛血清的1640培养基，置37 ℃的5 %二氧化碳的培养箱中全湿培养。

二、主要试剂ATRA、丁酸(BA)、硝基四氮蓝(NBT)购自Sigma公司，三丁酸甘油酯(TB)购自JT Baker公司。ATRA(1 mmol/L)和TB(1 mol/L)以无水乙醇制成储存液，BA(1 mol/L)以磷酸缓冲液制成储存液。

三、细胞生长、分化检测将各诱导剂储存液稀释至所需浓度，加入培养体系达到所需的效应浓度，并预先配置BA/ATRA(2000∶1)和TB/ATRA(2000∶1)联合应用的浓度比例，混合后加入培养体系，台盼蓝拒染判断细胞存活率，离心甩片制片，镜下观察细胞形态，NBT还原率评价细胞分化，方法参照文献^［1］。CD11b表达由流式细胞仪检测(Coulter公司Epics XL型)，间接免疫荧光标记，单抗购自法国Immunotech公司。

结果

1.ATRA、BA、TB、BA/ATRA及TB/ATRA对原代培养的APL白血病细胞存活率的影响各加药组对细胞存活率的影响与不加药组无明显差异(见图1)。

图1各诱导剂对细胞存活率的影响

2.细胞形态变化加入ATRA、BA/ATRA、TB/ATRA后细胞形态出现一定的变化，胞质颗粒减少，染色质浓缩，核质比例减少，部分核仁消失，并出现中、晚幼粒细胞及部分杆状核粒细胞。细胞形态以BA/ATRA、TB/ATRA组较单用组更为成熟，(见插页1，图1)为加入不同诱导剂后体外培养第3天细胞形态的改变。

3.BA、TB单独及联合ATRA对APL原代培养细胞体外分化作用比较以NBT还原率评价细胞分化率，显示BA、TB单独应用对APL原代培养细胞无明显的分化作用，而以BA、TB联合ATRA应用时，可显著增强ATRA对APL原代培养细胞的分化作用，单用ATRA组NBT还原率上升缓慢，而联合应用组上升迅速。如ATRA 1.0 μmol/L组NBT阳性率第2、第3天分别为31.56 ± 17.60、47.20 ± 18.79；联合BA/ATRA组为52.00 ± 13.24、73.40 ± 10.78，P均＜0.05，联合应用时ATRA浓度为0.1 μmol/L，对细胞分化强度仍高于单独应用ATRA 1.0 μmol/L组，在BA/ATRA与TB/ATRA两组作用强度相似(P＞0.05)。

4.CD11b表达的改变TB 0.2 mmol/L联合不同浓度ATRA诱导细胞第3天，流式细胞仪检测CD11b的表达均高于单独应用ATRA组，其中以TB联合ATRA 0.005 μmol/L组CD11b的表达明显高于单用组(P＜0.05)。说明(1)

图1不同诱导剂处理APL原代培养细胞3天后形态的改变(瑞氏染色×100)

A.对照组B.RA 0.1 μmol/LC.RA 0.1 μmol/L+TB 0.2 mmol/L(正文见第322页)

图2不同诱导剂对细胞分化作用的比较

图3TB 0.2 mmol/L联合不同浓度ATRA对CD11b表达的影响

5.体外分化结果与临床治疗相关性28例中26例体外分化阳性，其中21例经ATRA治疗33～52天，平均40.92±6.11天达完全缓解(CR)；2例体外分化阴性者经ATRA治疗24，32天，外周血象无白细胞高峰出现，复查骨髓原始+早幼粒细胞仍高达92 %及80.5 %，继续ATRA治疗，分别经ATRA诱导治疗84天、62天CR，明显长于上述21例(P＜0.05)。此外4例因弥散性血管内凝血，颅内出血死亡，1例治疗中因RA综合症大量心包积液填塞死亡。

讨论

ATRA对APL细胞的诱导分化作用，使大多数患者临床上得到缓解，但在ATRA使用过程中仍有一些问题尚待研究解决，如：1.治疗过程中维甲酸毒副作用，特别是高白细胞综合征及维甲酸综合征^［2］；2.缓解后单用ATRA往往数月内复发^［3］；3.治疗过程中细胞内维甲酸结合蛋白(CRABP)高表达及细胞色素P450酶促分解代谢使ATRA治疗失效^［4］等。有学者发现丁酸及其衍生物能协同ATRA诱导白血病细胞株的分化^［5］，丁酸类衍生物曾被应用于临床，使1例复发的急性髓系白血病得到部分缓解^［6］，以及1例经维甲酸、干细胞移植及三氧化二砷治疗第3次复发的APL患者获得完全缓解^［7］，而且体内应用毒副作用较轻微，有恶心、呕吐、便秘、肌痛等，最大剂量可用至45 000 mg，仅少数患者血清转氨酶及尿素氮轻度上升^［8］，因此具有一定的临床应用前景，为此作者观察了丁酸类衍生物联合ATRA对APL原代培养细胞在体外诱导分化作用。

本实验所选择的各诱导剂的浓度范围对细胞活力与对照组相比无明显差别，故所选择的浓度为非细胞毒的杀灭作用。ATRA及联合丁酸类衍生物可诱导细胞形态成熟化，形态变化以BA/ATRA、TB/ATRA组比ATRA单独组出现较早、成熟细胞所占比例较高；NBT还原率以BA/ATRA、TB/ATRA组高于单独应用ATRA组，而且联合应用时所需ATRA的效应浓度降低至单独应用时的10%(ATRA 0.1 μmol/L)，NBT还原率仍高于ATRA 1.0 μmol/L组。TB联合不同浓度的ATRA时CD11b表达同样均高于单用ATRA组。上述改变说明丁酸类衍生物联合维甲酸对APL原代培养细胞具有协同分化作用，可抑制细胞核中HDAC活性，导致核组蛋白H₃和H₄高度乙酰化和染色体结构开放，为大量酶复合物与DNA结合提供条件，从而活化基因的转录^［7］。而HDAC与细胞的诱导分化作用有关。维甲酸受 RARs与RXRs结合成的异二聚体复合物，在无配体(ATRA)存在时，RXR/RAR异二聚体与核内广泛存在的核蛋白(N-COR)互相结合成复合物，并与DNA相联，N-COR与m