摘要：目的研究白血病细胞细胞凋亡率与bcl-2和bax-alpha阳性率及表达水平关系。方法选择难治或复发的化疗耐药白血病患者和初治化疗敏感白血病患者各10例，分离白血病细胞，柔红霉素(500 ng/ml)诱导凋亡，应用流式细胞术比较分析耐药组和敏感组白血病细胞的凋亡率与bcl-2和bax-alpha阳性率和表达水平的关系。结果化疗耐药组和化疗敏感组对柔红霉素诱导的凋亡率有显著差异，敏感组(23.26 %±12.94 %)显著高于耐药组(2.26 %±1.44 %)，(P=0.001)；耐药组白血病细胞凋亡率与bcl-2阳性率呈负相关(r=-0.647，P=0.043)，与bax-alpha阳性率和相对荧光强度呈正相关(r=0.883，P=0.001；r=0.814，P=0.004)及bcl-2：bax-alpha比率呈负相关(r=-0.893，P=0.001)；敏感组凋亡率bax-alpha的阳性率和荧光强度呈正相关(r=0.653，P=0.041，r=0.762，P=0.010)，与bcl-2:bax-alpha比率呈负相关(r=-0.741，P=0.014)。结论白血病细胞耐药性与细胞的凋亡抗性有关，这种凋亡抗性与bcl-2和bax-alpha的表达比例增高有关，特别是bax-alpha的表达水平。

分类号：R7337；RT30.53文献标识码：A

文章编号：1000-7431(2000)05-0355-03

APOPTOSIS AND EXPRESSION OF bcl-2 and bax-alpha PROTEINS IN ACUTE LEUKEMIA CELLS

WANG Sui-zhao

（Department of Hematology, Guangdong Guangzhou 510282, P.R.China）

LIN Wei

（Department of Clinical Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Guangzhou 510282, P.R.China）

LIU Wen-sheng, et al.

Abstract：ObjectiveTo study the correlation of the cell apoptotic rate and the levels of bcl-2 and bax-alpha expression in leukemia patients.MethodsThe patients were divided into two groups:10 cases with chemo-resistant leukemie(refractory or relapsed leukemia) and 10 cases with chemosensitive leukemia (primary treated sensitive leukemia). Apoptotic reates of leukemia cells of both groups were detected by flow-cytometry DNA quntitative assay with PⅠ staine, which were induced with Daunorubicin (DNR 500 mg/ml).Multiparameter flow-cyto-metry measured the percentages and intensities of bcl2 and bax-alpha expression of leukemia cells of both groups.ResultsThe daunorubicin induced apoptotic rates were significantly different between chemosensitive and chemoresistant groups (P=0.001). The apoptosis of chemoresistant leukemia cells had correlation with percentage of bcl-2 positive cells (r=-0.647，P=0.043) and with percentage and level of bax-alpha expression (r=0.883，P=0.001；r=0.814，P=0.04)，and also with bcl-2/bax-alpha ratio(r=0.893，P=0.001) The apoptosis of chemosensitive cells was correlated with the positive percentage and level of bax-alpha expression (r=0.653 P=0.041； r=0.762，P=0.010), and with the bcl-2:bax-alpha ratio (r=0.741，P=0.014).ConclusionThe chemoresponse of both drug-resistant group and drug-sensitive groups of leukemia patients is associated with the apoptosis of leukemia cells induced by DNR which correlated with the bcl-2:bax-alpha ratio,especially with the bax-alpha expression.

Key words:Leukemia;Apoptosis;Gene，bcl-2；Gene,bax-alpha

尽管70 %～80 %的白血病患者经过标准化疗能够达到缓解，但这些患者中却仅有25 %的生存期能够超过5年^［1］。白血病细胞对化疗的抗性一直是患者生存的主要制约因素，难治和复发白血病是当前白血病治疗的难题。目前对白血病细胞耐药的内在机制尚不明了。近年的研究结果提出了细胞凋亡是化疗诱导白血病细胞死亡的模式，bcl-2基因家族在调节白血病细胞对凋亡的敏感性方面起核心作用^［2，3］。有关bcl-2蛋白与白血病细胞耐药关系的报道结果不一致^［4～6］。新近的研究提示，bcl-2与bax-alpha的比率可能是影响白血病细胞对化疗药物敏感性的关键因素^［6］。目前对于化疗敏感白血病和化疗耐药白血病凋亡率与细胞内bcl-2和bax-alpha表达水平的关系尚不明确。作者拟通过比较化疗敏感白血病和耐药白血病细胞内bcl-2和bax-alpha的表达水平，探讨白血病细胞耐药的分子机制。

材料与方法

一、病例的选择及样本采集初治化疗敏感的白血病患者10例(男7例、女3例，平均年龄26±12岁)和难治或复发化疗耐受的白血病患者10例(男8例、女2例，平均年龄31 ±16岁)，所有病例均符合FAB诊断标准。采集骨髓1 ml，用淋巴细胞分离液分离白血病细胞，涂片形态学检测白血病细胞大于85 %以上。加入等体积的培养液(RPMI-1640 含 10 % FBS，Hyclone Co.)，培养体系加入或不加柔红霉系(Daunorubicin, DNR，Farmitalia Carlo Erba, Italy)终浓度500 ng/ml，37 ℃ 5 % CO₂条件下培养12 h，取出少量细胞进行胎盼兰染色，活细胞大于90 %。

二、白血病细胞的DNA标记取培养细胞200 μl(10⁶细胞)，PBS洗涤2次，加入70 %乙醇固定细胞 4 ℃、避光温育30 min，离心，弃上清，PBS洗涤1次，弃上清，加入50 μl RNase A (5 mg/ml,Sigma Co.)，混匀后，温育5 min。然后加入450 μl PI(Propidium Iodide 50 μlg/ml， Sigma)混匀后，4 ℃、避光温育30 min。

三、白血病细胞内bcl-2抗体标记取新鲜的骨髓细胞100 μl的anti-human CD45抗体(Pharmingen Co.)，室温避光温育30 min，加入红细胞裂解液2 μl，避光温育5 min，离心弃上清，PBS洗涤1次，加入固定液(终浓度0.5 % Paraformaldehyde) 4 ℃,避光温育1 h，离心弃上清，用含0.05 % Tween-20的PBS悬浮，室温温育15 min离心弃上清，加入10 μl anti-human bcl-2-FITC (PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC (PharMingen Co.)，混匀后，4℃，避光温育30 min，加入0.05 % Tween-20(Sigma Co.)的PBS悬浮，4 ℃温育5 min，离心、弃上清，重复洗涤1次。

四、白血病细胞内bax抗体标记取新鲜的骨髓细胞100 μl，加入10 μl的anti-human CD45抗体，室温避光温育30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光温育5 min，离心弃上清，PBS洗涤1次，加入固定液(终浓度0.5 % Paraformaldehyde,Sigma Co.) 4 ℃、避光温育1 h，离心、弃上清，用含0.05 % Tween-20 的PBS悬浮，室温温育15 min，离心弃上清，加入10 μl mouse anti-human bax(PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC，混匀后，4 ℃、避光温育30 min，加入0.05 % Tween-20的PBS悬浮，4 ℃温育5 min，离心、弃上清，加入10 μl anti-mouse IgG1-FITC 抗体，混匀后，4 ℃、避光温育30 min，加入0.05 % Tween-20的PBS悬浮，4 ℃温育5 min，离心、弃上清，重复洗涤1次。

五、流式细胞术检测标记后的细胞于流式细胞仪FACSCalibur(Becton Dickinson)进行测定和分析，应用CellQuest软件获取数据，CellQuest软件分析细胞内bcl-2和bax因子的表达水平，ModFit软件分析细胞凋亡。

六、数据统计分析应用SPSS统计软件进行数据分析。(数据表示：均数±标准误 )

图8流式细胞术检测柔红霉素(500 μg/ml)诱导白血病细胞凋亡图

A.为对照组B.为耐药组C.为敏感组

图9白血病细胞内bcl-2和bax-alpha蛋白水平〔以检测荧光强度(红线)与对照本底(蓝线)的相对荧光强度表示〕。左侧为耐药组，右侧为敏感组。

10柔红霉素诱导的耐药组(A)和敏感组(B)白血病细胞凋亡率与bcl-2和bax-alpha比率的相关性分析。

结果

一、白血病的凋亡细胞分析耐药组白血病细胞凋亡率为2.26 %±1.44 %，敏感组白血病细胞凋亡率为23.26 %±12.94 %，前者显著低于后者(P＜0.01)，(见插页第Ⅱ页图8)。

二、白血病细胞凋亡率与bcl-2和bax-alpha表达水平的相关性分析鉴于bax-alpha为间接标记，难以直接测定细胞内蛋白的量，基于FITC荧光强度和结合的抗体数及与之结合的抗原数存在稳定的线性关系。在此以检测荧光信号与对照本底信号的相对比率即相对荧光强度，来间接反映bcl-2和bax-alpha蛋白的表达水平(见插页第Ⅱ页图9)。耐药组白血病细胞凋亡率与bcl-2细胞的阳性率呈负相关性(r=-0.647，P=0.05)、而与相对荧光强度均无相关性(r=-0.527，P=0.118)、与bax阳性率呈正相关性(r=0.883，P=0.01)，与bax-alpha阳性细胞的相对荧光强度呈显著正相关(r=0.814，P=0.041)、