摘要：目的在三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系中，在RNA水平及蛋白水平检测G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)与肿瘤转移潜能的相关性。方法研究对象为三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系，即PG(人肺巨细胞癌，裸鼠体内转移率100%)与PAa(人肺腺癌，无转移)；PG亚系BE1与LH7(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)；1E8与2B4来自人前列腺癌PC-3M(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)。检测方法包括Northern 杂交，蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学。结果应用mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的亚系BE1，LH7时，发现一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经Northern杂交验证其表达差异后测序，GenBank Blastn检索，与G3BP同源性高达99%。在三组具有不同转移潜能的癌系中，Northern杂交，蛋白质Western印迹免疫化学显示G3BP在低转移癌系LH7，2B4，PAa中表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG。免疫组织化学提示G3BP蛋白位于胞质，低转移癌系LH7，2B4，PAa表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG(PG各细胞染色不均一)。结论在mRNA水平和蛋白质水平，G3BP在三组高低转移癌系中的表达具有显著差异，在低转移癌系中的表达水平显著高于其所对应的高转移癌系，提示G3BP与肿瘤的转移表型可能具有相关性。

中图分类号：R73-37文献标识码：A

文章编号：1000-7431(2000)05-0325-03

G3BP EXPRESSION IN HUMAN CARCINOMA CELL SUBLINES WITH OR WITHOUT METASTATIC POTENTIAL

LIU Yu-xin, ZHENG Jie, FANG Wei-gang, et al.

(Department of Pathology, Beijing Medical University，Beijing 10083,China)

Abstract：ObjectiveThe relationship between G3BP (Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein) and cancer metastasis was studied. MethodsG3BP expression in three pairs of cancer cell sublines with/without metastatic potential (BE1/LH7, 1E8/2B4 and PG/PAa) was confirmed by Northern hybridization, Western blotting and immunohistochemical analysis. ResultsG3BP was obtaine by mRNA differential display and it displayed a strong expression in LH7 (no metastatic potential in recipient nude mice ) and a very weak expression in BE1 (100% metastatic frequency). Northern blotting and Western blotting with a polyclonal G3BP antibody confirmed an increased G3BP expression in non-metastatic cell lines (LH7, 2B4, PAa) compared with highly metastatic cell lines (BE1, 1E8, PG). Immunohistochemical analysis demonstrated a prominent granular pattern of G3BP accumulation in cytoplasm. ConclusionThe results revealed a significant association between G3BP expression and cancer metastasis, due to its different expressions in messenger RNA and protein level between the three pairs of cell sublines with different metastatic potentials.

Key words：Tumor cell,cluturedNeoplasm metastasis；G3BP

我室应用mRNA差异显示技术对比研究来自人肺巨细胞癌PG的亚系BE1，LH7时(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)，克隆一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性^［1］。现将研究对象扩展到另两组具有不同转移潜能的癌细胞系，包括人肺巨细胞癌PG(裸鼠体内100%转移)，人肺腺癌PAa(裸鼠体内不转移)，人前列腺癌PC-3M亚系1E8，2B4(我室分离建立，前者裸鼠体内100%转移，后者无转移)^［2］；同时将检测方法由差异显示扩展到RNA水平(Northern杂交)，蛋白水平(蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学)检测G3BP与肿瘤转移潜能的相关性，为G3BP参与肿瘤转移这一假设提供依据。

材料与方法

一、细胞培养人肺巨细胞癌PG及其亚系BE1、LH7、人肺腺癌PAa，人前列腺癌PC-3M亚系1E8、2B4，以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37 ℃，5 % CO₂培养箱中。

二、Northern杂交异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A_{260 nm}，计算RNA含量，取15 μg 总RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜80℃烤90 min。以G3BP PCR产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm²加预杂交液(6×SSC，50 % 甲酰胺，1 % SDS，1×Denhard试剂)，42 ℃预杂交3 h后加入已100 ℃变性5 min的探针，42 ℃杂交过夜。以2×SSC，0.1 % SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1 % SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min2次。膜在2×SSC中漂洗后放射自显影1～3天，以β-actin作为内参照。

三、蛋白质Western印迹免疫化学生长状态良好的细胞PBS洗两遍，用细胞刮子收集细胞，加入100 μl悬浮缓冲液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.6，0.01 mol/L EDTA pH 8.0，100 μg/ml 苯甲基磺酰氟)混匀，加100 μl 2×SDS 上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，200 mmol/L DTT， 4 % SDS，0.2 %溴酚兰，20 % 甘油)混匀，冰浴30 min，100 ℃ 10 min，超声裂解至溶液的粘稠度可控，10 000转离心10 min，收集上清分装。Lowry法测定蛋白浓度^［3］，配置5%浓缩胶：水3.4 ml，30%丙烯酰胺0.83 ml，1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 0.63 ml，10 % SDS 0.05 ml，10 % AP 0.05 ml，TEMED 0.005 ml；10 % 分离胶：水4.0 ml，30 %丙烯酰胺3.3 ml，1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 ml，10 % SDS 0.1 ml，10 % AP 0.1 ml，TEMED 0.004 ml。取各细胞系蛋白 100 μg， 100 ℃变性 5 min，4 ℃，电泳4～6 h(浓缩胶100 V，分离胶120 V)，电泳缓冲液为25 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L 甘氨酸 pH 8.3，0.1 % SDS。电泳结束后将凝胶置于电转移缓冲液中(39 mmol/L 甘氨酸，48 mmol/L Tris， 0.037 % SDS， 20 % 甲醇)浸泡30 min，用夹心法把滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸依次固定，插入电转移槽中，凝胶在阴极，硝膜在阳极方向，加入转移缓冲液，50 V、4℃ 转移12～14 h。硝膜以丽春红染色，对照蛋白分子量标志剪下相应部位的硝膜放入杂交袋中，5% 脱脂奶粉/PBS封闭1 h，然后按0.2 ml/cm²加入一抗(兔G3BP多克隆抗体，由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠，1∶500稀释)4 ℃过夜。0.05 %吐温/PBS洗膜15 min 3次后，加入羊抗兔的IgG-HRP(1∶2000)室温1 h。用0.05 %吐温/PBS洗膜15 min3次。采用发光试剂(Santa Cruz生物技术公司)检测特异条带，X光片曝光。

四、免疫组织化学采用ABC试剂盒(Vector公司)，G3BP多克隆抗体由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠。细胞培养于载玻片上24 h，丙酮固定30 min，PBS洗3次共15 min，0.3 % H₂O₂灭活内源性过氧化氢酶30 min，PBS洗，0.3 % Triton打孔5 min，PBS洗，10 %兔血清封闭37 ℃ 30 min，PBS洗，滴加G3BP多克隆抗体(1∶500)，湿盒中温育4 ℃过夜，PBS洗，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，室温1 h，PBS洗，滴加AB液(A与B液等量，于用前30 min混匀)，室温30 min，PBS洗，0.04% DAB加入0.03% H₂O₂显色10 min，充分水洗，苏木素复染，中性树脂封片，镜检。凡细胞质内出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度分级：根据阳性细胞占全部细胞的比例分为，阴性(-)，无阳性细胞或阳性细胞数少于5%；阳性(+)，阳性细胞占5 %～50 %；强阳性(++)，阳性肿瘤细胞＞50 %。同时以PBS替代一抗作为空白对照。

结果

一、Northern杂交如图1所示，mRNA水平，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，在低转移癌系中的表达高于其相应的高转移癌系：可见PAa杂交信号强于PG；LH7杂交信号强于BE1；2B4杂交信号强于1E8。根据G3BP的杂交信号位置估计其mRNA约3.3 kb，与文献报道相符。下图显示β-actin作为内参照，在6个细胞系中杂交信号强度一致。

二、蛋白质Western印迹免疫化学如图2所示，蛋白质水平，G3BP在各细胞系中 有不同水平的表达，G3BP在低转移癌系中的蛋白表达高于其相应的高转移癌系：PAa阳性信号强于PG；LH7阳性信号强于BE1；2B4阳性信号强于1E8。阳性信号位于68 kD处，与文献报道相符。

三、免疫组织化学(见插页第Ⅰ页图2)所示，免疫组化阳性信号为位于胞质的棕黄色颗粒，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，PAa(++)，PG(+)，PG是由具有不同转移潜能的亚系组成的母系，可见PG各细胞的染色不均一，说明各细胞中G3BP的表达水平不同，表现出一定的异质性；LH7(++)显著强于BE1(+)；2B4(++)显著强于1E8(-)。

图2G3BP在细胞内的免疫组化，阳性信号即位于胞质的棕黄色颗粒(正文见第325页)