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中图分类号：R965.1文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)04-0241-04
MDR HUMAN BLADDER CANCER CELLS LINE ESTABLISHED BY RETROVIRUS INFECTION
YI Shan-hong
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
YANG Tang-jun
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
HE Bin, et al.
(Department of Urology,Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
Abstract：ObjectiveTo establish a MDR human bladder cancer cells line.MethodsHuman bladder cancer cells were transfected by mdr1 retrovirus supernatant. Multidrug resistance of cancer cells was tested by MTT assay; expression of P-GP on membrane and mdr1 mRNA in cells was detected with immunocytochemistry and in situ hybridization. The presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1 was detected by polymerase chain reaction (PCR).ResultsThe pT24mdr1 cell line was found to be 8 times more resistant to adriamycin and 21 times to colchicine than T24, and showed stable resistance to both adriamycin and colchicine; through immunocytochemistry assay with McAb against P-GP, pT24mdr1 cells expressed P-GP higher than T24 on the membrane. The pT24mdr1 cells showed much higher mdr1 mRNA level in contrast to T24 by in situ hybridization. The result of polymerase chain reaction verified the presence of mdr1 cDNA in genome of pT24mdr1.ConclusionGene transfer by retrovirus is a satisfied method in establishing MDR human bladder cancer cells line.
Key words：Bladder neoplasma;Multidrug resistance;Retrovirus;Gene transfer;Tumor cells,cultured
人类肿瘤化疗效果不理想的一个主要原因是由于多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)的产生，目前认为MDR主要和mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-GP)有关［1］。本研究采用逆转录病毒转染向膀胱癌细胞T24内转移mdr1基因，秋水仙素耐药性筛选，并建立转基因细胞系pT24mdr1，探讨多药耐药性的P-GP机理，为逆转细胞的多药耐药性提供高效、稳定的MDR人膀胱癌细胞模型。
材料与方法
一、T24为浸润性人膀胱癌细胞，北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。质粒pHaMDR1/A为带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体，经导入细胞后表达全长的mdr1 mRNA［2］。质粒pHDR5A携带有1386 bp长mdr1基因片段，经酶切后获得的片段用于制作分子杂交探针。PA317、NIH3T3细胞，第三军医大学分子生物教研室提供。
二、引物mdr1基因核酸序列本科设计［3］，上游引物设在mdr1基因的第21外显子上，序列为5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物设在mdr1基因的第22外显子上，序列为5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增的片段长度为157 bp。
三、病毒包装、收集及滴度测定采用脂质体转染试剂DoTaP介导，将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA导入包装细胞系PA317细胞，并以60 ng/ml秋水仙素选择性筛选。细胞生长达80%融合，收集细胞培养上清液：经0.45μm孔径的过滤器过滤，-70℃保存。NIH3T3法测定病毒滴度。
四、病毒上清液RNA的鉴定及辅助病毒检测参照TriPureTM试剂盒说明提取病毒上清液RNA，逆转录合成cDNA，所得产物用于PCR扩增，循环参数为94℃×50s,55℃×50s，72℃×60s，共35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。收集转染阳性NIH3T3细胞的培养上清液，0.45 μm微孔过滤器过滤后再次感染NIH3T3的亲代细胞，秋水仙素筛选，观察有无细胞克隆生成。
五、转染T24细胞对数级生长的T24细胞中加入含8 μg/ml聚凝胺的病毒上清液1 ml，吸附约12 h；新鲜培养液培养48 h后，加用秋水仙素60 ng/ml选择培养，筛选出转染阳性细胞，命名为pT24mdr1。
六、细胞生物学特性及耐药性分析分别测定T24、pT24mdr1细胞的生长曲线，计算各自的倍增时间；记录细胞的生长条件，观察两细胞的消化特性。MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)、秋水仙素(COL)的耐药性。
七、P-GP免疫细胞化学染色：SP法染色。
八、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达质粒pHDR5A转化、提取、纯化、限制性酶切并回收片段，应用地高辛进行标记，检测细胞mdr1 mRNA的表达。杂交结果判断：细胞浆内呈现紫兰色颗粒者为阳性信号，阴性不着色。
九、PCR检测细胞基因组DNA：引物同前。TriPure［TM］试剂盒说明提取细胞总DNA，扩增条件：96℃预变性3 min，94℃变性50s,55℃退火50s，72℃延伸60s，PCR扩增35个循环，72 ℃延伸9 min。所得产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果
一、病毒上清液的收集、浓缩及滴度测定经DoTaP介导将pHaMDR1/A重组逆转录病毒载体DNA转染PA317细胞，以秋水仙素作耐药性筛选得到抗性克隆，命名为PAmdr1。细胞培养液经过滤，获病毒上清液，NIH3T3细胞感染法测定其滴度为3.1×105 CFU/ml。
二、病毒上清液RNA的鉴定和辅助病毒检测PAmdr1细胞的培养上清液RNA扩增出特异性mdr1 157 bp条带，PA317细胞未扩增出此特异性的条带(见图1)。以转染阳性的NIH3T3细胞的培养液进一步感染亲代细胞NIH3T3，未出现抗性细胞。
图1各细胞培养上清液RNA的RT-PCR结果
←为mdr1 157bp1.复华DNA Marker
2.pAmdr1细胞3.pA317细胞
三、逆转录病毒对T24细胞的转染感染12 h之后换用筛选液(COL终浓主为60 ng/ml)，第2天出现大量的悬浮细胞，第7天基本无悬浮细胞出现。第4周开始有细胞增生，并出现细胞岛，转移其中较大的一个细胞岛至另一培养瓶中，继续COL筛选，将此克隆细胞命名为pT24mdr1。
四、细胞的生长曲线及生物学特性同亲代细胞T24相比，pT24mdr1的形态无明显的变化，细胞内无明显的颗粒及空泡；二者的生长曲线大致相同，细胞倍增时间分别为24.2和25.1 h；两细胞的消化特性及培养条件也无差别。
五、细胞的耐药性pT24mdr1细胞在ADM浓度小于0.78 μg/ml时，与T24细胞相比细胞存活率出现了显著性差异(P＜0.01)，半数致死量(IC50)值分别为1.62、0.199 μg/ml。pT24mdr1细胞在COL浓度小于3000 ng/ml时，与T24细胞相比有显著性差异(P＜0.01)，两细胞对COL的IC50值分别为740、33 ng/ml。
六、免疫组化对细胞膜P-GP的检测T24细胞染色为弱阳性，pT24mdr1细胞为强阳性染色。
七、原位杂交检测细胞内mdr1 mRNA的表达pT24mdr1细胞可见很强的胞浆颗粒状着色，呈蓝紫色，主要位于细胞浆内，以核周染色较深。T24肿瘤细胞也可见到胞浆内蓝紫色的着色，较pT24mdr1染色明显浅淡(见封三图1)。
图1pT24 mdr 1细胞原位杂交结果．（mdrl DNA探针）
八、PCR检测pT24mdr1细胞基因组中mdr1cDNApT24mdr1细胞出现mdr1 cDNA的157 bp扩增条带，T24细胞则无此条带，见图3。
图3细胞基因DNA的PCR结果
1.pGEM-725(+)+HaeⅡ marker
2.pT24md
