摘要：目的研究双炔失碳酯(ANO)及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲酸(ATRA)对Swarm大鼠软骨肉瘤(SRCS)体内外生长的影响和机制。方法观察药物SRCS在小鼠肾囊腺下体内生长的影响；von Kossa法观察药物治疗对SRCS中钙盐沉积的作用；用台盼蓝排染法观察了药物对SRCS细胞体外生长的影响；以对硝基苯酚磷酸酯为底物研究药物对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响；用邻甲酚酞络合酮比色法测定SRCS细胞中的钙含量。结果几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下体内生长均有程度不一的抑制作用，α-ANO在20 mg/kg剂量下的生长抑制率为79.4 %；CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96 h对SRCS细胞体外生长的IC₅₀分别为0.45、1.47、115.2、161.7和241.5 μmol/L；α-ANO和ATRA在体内可引起SRCS中出现钙盐沉积；在体外作用96 h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙含量显著性升高；而CDDP和TAM无上述现象。结论α-ANO和ATRA抑制SRCS生长与其诱导SRCS向成骨化方向分化有关，提示诱导分化治疗可能为临床治疗软骨肉瘤的新的有效途径。

中图分类号：R73-361；R738.3文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)04-0237-04

INHIBITORY EFFECT OF α-ANORDRIN AND OTHER DRUGS ON THE GROWTH OF SWARM RAT CHONDROSARCOMA IMPLANTED INTO SUBRENAL CAPSULES OF MICE

MA Zhong-cai

(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)

HE Geng-hua

(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)

ZHANG Zhou, et al.

(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)

Abstract：ObjectiveTo study the influence of anordrin (ANO)，α－ANO, tamoxifen (TAM)，cisplatin (CDDP) and all-trans retinoic acid(ATRA) on the growth of Swarm rat chondrosarcoma (SRCS).MethodsEffects of drugs on the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice were studied in vivo. Calcium deposits in SRCS were revealed by von Kossa staining. Trypan-blue exclusion method was used for examining the growth condition of SRCS cells cultured in vitro. The alterations of alkaline phosphatase (ALPase) activity of SRCS cells were observed with p-nitrophenyl phosphate as substrate. o-Cresolphthalein complexone colorimetry was employed to study the calcium content of SRCS cells.ResultsThe tested drugs could inhibit the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice at different degrees, and α－ANO caused 79.4% inhibition at the dosage 20 mg/kg. The IC₅₀ of CDDP,ATRA,TAM, α－ANO and ANO for SRCS cells after 96 h treatment wree 0.45, 1.47, 115.2, 161.7 and 241.5 μmol/L respectively. Calcium deposits were observed in SRCS treated by α－ANO and ATRA in vivo. α－ANO and ATRA also induced a significant elevation of ALPase activity and calcium content in SRCS cells in vitro for 96 h treatment. These phenomena were not observed in SRCS treated by CDDP and TAM.ConclusionInducing SRCS toward differentiation and ossification was involved in the growth inhibition of SRCS caused by α－ANO and ATRA, but not by CDDP and TAM. The differentiation-induction may be a new approach for clinical therapy of chondrosarcoma.

Key words：Chodrosarcoma;α－Anordrin;Tretinoin;Cell differentiation

Swarm大鼠软骨肉瘤(Swarm rat chondrosarcoma,SRCS)由一18个月的雌性Sprague-Dawley大鼠中形成的自发肿瘤经连续传代分离建株而成^［1］，参照O′Neal氏软骨肉瘤分级标准^［2］，SRCS属2级恶性程度较高的一种，可以作为研究人软骨肉瘤的一个良好实验模型。

双炔失碳酯(Anordrin，ANO)是一种A环失碳的雄甾烷衍生物，对雌激素有部分拮抗活性，作为抗着床避孕药已被广泛应用。1989年本实验室首先发现它具有抗肿瘤活性，并且该活性主要来自其α异构体^［3］。

本文观察了ANO及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲维(ATRA)等药物对SRCS在小鼠肾囊膜下和体外生长的影响，并对几种药物抑制SRCS生长的机制作了初步探讨。

材料和方法

一、瘤株

SRCS从中国医科院药物研究所引种。Wistar大鼠皮下接种，每6周传代1次。

二、药物与主要试剂

ANO，上海第十九制药厂生产，α-ANO由本所植化室用氧化铝低压层析法分离制备；CDDP，齐鲁制药厂生产；ATRA、Ⅱ型胶原酶，Sigma产品；TAM，上海华联制药厂生产；胰蛋白酶，Serva产品；DMEM培养基，GIBCO产品；小牛血清，华东理工大学产品；对硝基苯酚磷酸酯(p-NP)，Merck产品；邻甲酚酞络合酮，上海第三试剂厂产品。

三、动物

昆明种小鼠23～25 g，雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。

四、方法

1.小鼠肾囊膜下移植SRCS及药物治疗^［4］

实验前1天小鼠腹腔注射环磷酰胺(150 mg/kg)作免疫抑制。选取生长4周的SRCS，在DMEM(含15%小牛血清)中无菌条件下剪成均匀的2 mm³左右大小的瘤块备用。小鼠先用水合氯醛麻醉，从背部暴露肾脏，用16号穿刺针将瘤块移植到肾囊膜下，然后把肾脏复位，缝合切口，随机分组，第2天开始给药，剂量和给药途径见表1，共5天，第7天观察结果。取出荷瘤肾脏，在装有目镜测微尺的解剖镜下测量瘤块的最长径(a)和最短径(b)，理论瘤体积(mm³)=0.52ab²，肿瘤生长抑制率(%)=(1-给药组瘤体积/对照组瘤体积)×100%

2.von Kossa法观察钙盐沉积

荷瘤肾脏10%福尔马林固定，常规包埋切片。

参照文献^［5］，略有改动。切片覆以5%硝酸银溶液，紫外灯下照射30～40 min，然后于5% 硫代硫酸钠水溶液中处理3～5 min，1%中性红复染数秒，中性树胶封片。

3.几种药物对SRCS细胞体外生长的影响

SRCS原代培养在靠近边缘、无坏死和瘀血区域无菌剪取SRCS 10 g左右，去除包膜等结缔组织，剪成小块。于5% (W/V)胰蛋白酶(含等体积1 mmol/L EDTA)中37 ℃消化1 h，再用胶原酶(160 u/ml)37 ℃消化2 h，然后用100 目和400 目筛网过滤，收集滤液，用DMEM(含15%小牛血清，2 mmol/L Gln，1 μmol/L氢化可的松，15 mmol/L HEPES 洗3次，稀释到10⁶/ml培养，台盼蓝染色证明90 % 以上为活细胞。

96孔培养板上每孔接种150 μl SRCS细胞(3×10⁵/ml)，4 h后加入不同浓度的各种待试药物，培养4天后用台盼蓝排染法计数各组活细胞数，计算细胞生长抑制率，由Logit法计算各药物的IC₅₀值。

4.几种药物体外对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响^［6］

接种SRCS细胞(2×10⁵/ml) 4 h后加入不同浓度的各种药物，作用96 h后收集细胞，用台盼蓝排染法计数活细胞数，然后用0.9% NaCl溶液(含0.2% Triton X-100)悬浮，0 ℃匀浆，12 000×g离心15 min，取上清与0.01 mol/L Tris-HCl反应缓冲液(pH 9.0,含0.5 mmol/L p-NP 和0.5 mmol/L MgCl₂)混匀，37 ℃精确保温30 min，用0.25 %体积的1 mol/L NaOH终止反应，在410 nm处测OD值。用对硝基苯酚作标准曲线。一个酶活力单位(u)定义为37 ℃和pH 9.0条件下，以p-N为底物30 min内水解释放出1 μmol/L对基苯酚的酶量。结果以u/10⁶细胞表示。

5.几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响

收集不同浓度的几种药物作用96 h后的SRCS细胞，用0.1 N盐酸悬浮，4 ℃过夜后1500 r/min离心5 min，取上清。用邻甲酚酞络合酮直接比色法^［7］和Bradford法^［8］分别测定上清中的钙浓度和蛋白质浓度，SRCS细胞中钙含量以nmol/mg蛋白表示。

6.统计学处理

实验数据以±s表示，先作两组资料的方差齐性分析，方差齐时，用Student's t检验，方差不齐时，用Mann-Whitney检验比较均数差异的显著性。

结果

一、几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的影响

结果示于表1中。在几种药物中