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摘要：目的探讨影响端粒酶活性因素及可能机理。方法使用PCR-ELISA法半定量检测端粒酶活性，并进行细胞周期、形态学观察。以人类早幼粒白血病细胞HL-60(Ⅰ)和全反式维甲酸(ATRA5μM)处理72 h的HL-60细胞(Ⅱ)为实验对象。再用一定浓度的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液(MCS)体外刺激实验细胞。结果实验细胞Ⅱ在5% MCS作用下，较对照无明显差异；受20 % MCS作用48 h，端粒酶活性可明显上调(P＜0.05)，在第3天酶活性下降；在20%、40% MCS作用下较对照均明显增高(P＜0.05)，但两者(20%与40%)间无明显差异；MCS直接作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物，未见端粒酶活性明显变化。实验细胞Ⅱ在持续的MCS作用下培养2周，恢复恶性增殖能力。端粒酶活性变化受细胞群主体分布影响不大。MCS作用于具有高端粒酶活性的实验细胞Ⅰ，未发现明显促进作用。无MCS的培养体系中，小牛血清浓度不影响实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶活性。结论ATRA处理的HL-60细胞的端粒酶是可调节的，未活化的巨噬细胞培养上清液可对其活性进行有效上调，而对HL-60细胞高水平表达的端粒酶活性影响不大。
STUDY ON TELOMERASE ACTIVITY IN HL-60 CELLS STIMULATED BY SUPERNATANT OF CULTURED MACROPHAGE
ZHOU Jian-fang,TANG Wei-xue,CHENG Ping-yan.
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400046,China)
Abstract：ObjectiveStudy on the factors influencing telomerase activity and the possible mechanism.Methods Telomerase activity were analyzed by PCR-ELISA as well as cell cycle and morphology in human promyeloid leukemia HL-60 cells. HL-60 cells were treated in group Ⅱ with or in group Ⅰ without all-trans-retonic acid(ATRA) and,then were stimulated by supernatant of cultrued murine peritoneal macrophage.Results After about 48-hour culture of group Ⅱ in the presence of 20% supernatant,telomerase activity was significantly up-regulated (P＜0.05) and was decreased on day 3.As compared with group Ⅰ,20% or 40% supernatant could up-regulate telomerase activity of group Ⅱ significantly (P＜0.05). Two-week culture of group Ⅱ with persistent supernatant could direct HL-60 resuming its malignant status.Conclusions The telomerase activity in ATRA-treated HL-60 cells can be regulated, and supernatant of cultured inactive macrophage can up-regulated the activity effectively,but has littel influence on the high telomerase activity in HL-60 cells.
Key words：Telomerase；Macrophage；HL-60 cells；Tretinoin；Cell cycle
巨噬细胞(Mφ)为多功能间质细胞，在体内具有双重性作用。一方面发挥重要的免疫防护功能，另一方面由肿瘤衍生的趋化因子引进肿瘤内的单核巨噬细胞，在肿瘤生长旺盛期受不同内环境的影响，对肿瘤细胞的免疫监视、免疫清除功能降低，反而促进肿瘤的生长和转移［1］。Gorelin报道未活化巨噬细胞和瘤细胞直接接触，有促进瘤细胞生长的作用［2］。陈慰峰［3］、王宗惠［4］报道未活化巨噬细胞培养上清液(MCS)具有促进杂交瘤/瘤细胞生长的生物活性物质的存在。端粒酶则是近年肿瘤研究领域的新热点，瘤细胞的永生性与端粒酶活性有关。对于巨噬细胞促进瘤细胞生长及杂交瘤细胞成活机理尚不清楚，而MCS能否上调瘤细胞端粒酶活性亦未见报道。本文将实验研究结果报道于下。
材料与方法
一、材料
1、动物BALB/c小鼠，9～12周龄，雄性。由本校动物中心提供。
2、巨噬细胞培养上清液(MCS)制备禁食8 h小鼠，断颈处死小鼠，收集腹腔渗出细胞，加入RPMI 1640培养液，混匀后置37℃，5% CO2饱和湿度温箱内培养3 h，除去非贴壁细胞，加入RPMI 1640培养液(10% FCS)，调整至106个细胞/ml，培养1周，制备培养上清液，-20℃保存备用，用前室温融化。
3、实验细胞实验细胞Ⅰ、人类早幼粒白血病细胞HL-60(军科院药理研究室提供)取对数生长期细胞。
实验细胞Ⅱ、全反式维甲酸(ATRA Sigma)处理的HL-60细胞ATRA用无水乙醇配制成10-2mol/L，置于-20℃避光保存，用RPMI 1640稀释成工作液浓度。指数生长期HL-60细胞以2×105/ml密度种于100 ml培养瓶内，ATRA终浓度5 μmol/L，避光在37 ℃ 5% CO2条件下培养72 h，1000 r/min离心5 min收集细胞，用Hank′s液洗涤2次，所获得的细胞作为实验材料。
二、方法
1.RT-PCR测定端粒酶活性(Telomerase PCR ELISA试剂盒Boehringer Mannheim)
收集待测细胞，用Hank′s液洗涤2次，取106细胞加200 μl CHAPS裂解液冰浴30 min，低温离心机中4℃ 12 000 g离心20 min。取175 μl上清-80 ℃保存待测。
取2 μl细胞提取物，按药盒说明书，加入反应底物，总体积为50 μl，30 ℃逆转30 min，在Bio-Rad 2400 PCR扩增仪(Bio-Rad美国)经94 ℃ 5 min灭活后经94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 30个循环，72 ℃ 10 min扩增。PCR产物4 ℃保存。
按药盒说明书，取5 μl PCR反应产物加入20 μl变性液中，室温放置10 min，再加入225 μl杂交液，充分混匀，取100 μl加入亲和素包被的96孔板内。该试剂盒利用亲和素吸附固定由端粒酶逆转录再经PCR扩增的产物，加入特异性的地高辛标记的核苷酸探针和抗DIG-POD抗体半定量检测，底物为TMB。在自动酶标仪上比色，测量OD值，波长为450 nm，690 nm。重复3次，双孔平行。待测孔OD值=OD450值-OD690值，阴性对照＜0.2，阳性对照＞1.0为有效测定，方可判定实验结果。实验分5组：(1)常规培养不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)培养体系含不同浓度的小牛血清的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(3)培养体系含不同浓度的MCS的实验细胞Ⅱ，以无MCS的作自身对照。(4)MCS作用不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ，分别以无MCS的作为自身对照。(5)MCS作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ端粒酶提取物即各取10 μl新鲜制备细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物与10 μl MCS 25 ℃温育30 min，取混合物4 μl加入PCR反应体系，测定端粒酶活性。
2.细胞周期分析-流式细胞光度术
收获细胞，70 %乙醇40℃固定4 h以上，用碘化丙啶(DAPI)染色，FACS Calibar流式细胞仪(B.D美国)，作DNA单参数分析，以正常人淋巴细胞作对照，所得数据采用仪器程序cell quest计算各期细胞比例。实验分2组：(1)MCS培养48 h的实验细胞Ⅰ及无MCS的自身对照。(2)MCS培养不同时间的实验细胞Ⅱ及无MCS的自身对照。
3.透射电镜检查
收集细胞用2.5%戊二醛固定，继用2%四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色按常规处理。实验分2组：(1)实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)实验细胞Ⅱ在10% FCS、40% MCS RPMI中培养，对照为实验细胞Ⅱ在10% FCS 无MCS RPMI 1640中培养，培养2周，隔3～4天，弃一半培养液，加入新鲜培养液，成分组成不变。因对照细胞量不足，未能电镜检查。
结果
一、端粒酶活性测定
收集常规培养条件下培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测实验细胞Ⅰ表达高端粒酶活性，OD值为0.997～1.105，较稳定，0 h测OD值为1.102±0.089。实验细胞Ⅱ端粒酶活性明显降低，培养0 h测OD值为0.511±0.167(P＜0.01)，为原酶活性的40%～50%，后逐渐降低，96 h OD值为0.202，接近阴性对照。
2.收集含5 %、10 %、15 %、20 %小牛血清培养48 h的实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测
小牛血清浓度不影响端粒酶活性，实验细胞Ⅰ的OD值为0.972～1.166，实验细胞Ⅱ的OD值为0.508～0.572，故选用常规10% FCS RPMI 1640培养。因使用无血清培养条件下待测细胞数目不能满足，未能测定无血清培养对端粒酶活性影响。
3． 5 %、20 %、40 % MCS作用实验细胞Ⅱ 48 h检验
实验组细胞较未经MCS作用的对照细胞端粒酶活性均增高，分为0.522±0.11、0.806±0.16、0.925±0.09，对照组为0.367±0.13，实验组中后2组较对照有统计学意义(P＜0.05)，但两者(20%与40% MSC实验结果)间无明显差异，提示20% MCS已足以提高端粒酶活性。以20 % MCS作用于实验细胞Ⅱ 48 h重复测定6次，实验组为0.826±0.229，较对照组0.411±0.208明显增高(P＜0.05)。
4.MCS对实验细胞端粒酶活性影响的时效关系
MCS对实验细胞Ⅰ端粒酶活性影响不大(见图1)，实验细胞Ⅱ在20%的MCS作用下，24 h内即有明显上调，可持续作用48 h左右，培养第3天时有所降低，仍高于对照，但无明显差异(见图2)。
