摘要：目的以mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的癌系，克隆与肿瘤转移相关的基因。方法以肺巨细胞癌细胞系PG具有不同转移潜能的亚系(BE1，LH7)为研究对象，应用mRNA差异显示技术克隆差异片段，经Northern杂交验证后测序，进入GenBank数据库检验同源性。结果mRNA差异显示技术对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。其中一个849 bp片段在高转移亚系(BE1)低表达，而在不转移亚系(LH7)高表达，两者差异显著，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。结论在高低转移癌系中G3BP的表达具有显著差异，提示G3BP与肿瘤的转移表型有一定相关性，为G3BP功能的研究提供了新的线索。

IDENTIFICATION OF G3BP DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN HUMAN LUNG GIANT CELL CARCINOMA SUBLINES WITH DIFFERENT METASTATIC CAPACITY BY MESSENGER RNA DIFFERENTIAL DISPLAY

LIU Yu-xin,ZHENG Jie,FANG Wei-gang,et al.

(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing100083,China)

Abstract：ObjectiveThe Messenger RNA Differential Display technique was used to identify mRNAs expressed differentially in human lung giant cell carcinoma sublines with different metastatic capacity and to find out the metastasis related gene.MethodsDifferent metastatic potency sublines of human lung giant cell carcinoma PG line was studied by mRNA differential display technique.After Northern hybridization and sequencing,the DNA sequence was checked with GenBank data for homology.ResultsA clone was isolated,which is uniquely expressed in the low-metastatic subline LH7.DNA sequence of the clone was checked in the database of Genbank by Blastn and indicated a significant homology to G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein).ConclusionsG3BP is uniquely expressed in the low-metastatic human lung giant cell carcinoma subline LH7,so it might have some relationship with cancer metastasis.

Key words：Lung neoplasms；Neoplasm metastasis；Gene,G3BP;Tumor cells,cultured

临床资料表明很多肿瘤病人的死因并非原发癌，而是肿瘤的转移，因此肿瘤转移机制的探讨是人类与肿瘤的战斗中重要一役。mRNA差异显示技术(mRNA Differential Display)^［1］是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法，已被广泛应用于克隆新基因及研究已知基因新功能。我室应用该技术对比高低转移癌细胞系mRNA时，发现一个849 bp片段在高转移癌细胞系低表达，而在低转移癌细胞系高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。为G3BP功能的研究提供了新的线索，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性。

材料和方法

一、细胞培养

人巨细胞肺癌PG亚系BE1和LH7以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37℃，5% CO₂温育箱中。

二、细胞总RNA提取及DNaseⅠ处理

生长状态良好的BE1和LH7，弃培养液，预冷的PBS洗2次，按照TRIzol(GIBCO BRL)说明书提取细胞总RNA。2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳检测RNA质量，28 S与18 S比例约1.5～2.5∶1。50 μg RNA中加入RNase抑制剂(1 U/μl)10 μl，无RNase的DNase I(10 U/μl)1 μl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.3) 5 μl，0.5 mol/L KCl 5 μl，15 mmol/L MgCl₂ 5 μl,37℃温育30 min去除DNA污染。加入等体积的酚/氯仿(3∶1)，用力震荡，12 000 g离心2 min，移上层至新管中，加入3 mol/L乙酸钠5 μl，无水乙醇200 μl，-70℃过夜沉淀RNA。12 000g离心10 min，弃上清，70%乙醇500 μl洗沉淀。干燥后溶于DEPC水20 μl，取2 μl稀释至500 μl用分光光度计测A_260nm，计算RNA含量，取3 μg RNA电泳以检测RNA的完整性，其余冻存于-70℃。

三、合成第一链cDNA

取BE1和LH7细胞总RNA各2 μg，分别加入cDNA合成引物1 μl〔即1 μmol/L oligo(dT)〕，加DEPC水至终体积5 μl。混匀后稍离心，65 ℃温育3 min后置于冰上，加入5×逆转录缓冲液2 μl〔250 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，375 mmol/L KCl，30 mmol/L MgCl₂〕，5 mmol/L dNTP 2 μl，MMLV逆转录酶1 μl(200 units/μl)，混匀后稍离心，42℃温育90 min，75℃ 10 min终止反应。将2 μl移至另一管，分别在两管中加DEPC水至终体积80 μl(各稀释20倍和40倍)，保存于-20℃。

四、mRNA差异显示

按照Clontech公司Delta^TM差异显示试剂盒说明书操作。两个稀释度的cDNA，水，2 μg细胞总RNA(阴性对照)分别作为模板进行反应。2 μl cDNA，20 μmol/L锚定引物1 μl，20 μmol/L随机引物1 μl，10×PCR缓冲液2 μl，5 mmol/L dNTP 0.2 μl，［α-³²P］dCTP(3000 Ci/mmol，亚辉公司)0.2 μl，50×Taq酶(Clontech公司)0.4 μl，加水至20 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为：第1个循环94℃ 5 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第2～3个循环94℃ 2 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第4～25个循环94℃ 1 min，60℃ 1 min，68℃ 2 min；68℃延长7 min。PCR产物冻存于-20 ℃。

五、电泳，放射自显影

以19∶1单双丙烯酰胺储存液配制5%变性丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，灌胶3 h后，以0.5×TBE为电泳缓冲液，预电泳33 mA 30 min，混合5 μl PCR产物和5 μl上样缓冲液，94 ℃变性2 min后立即置冰上，冲洗上样孔后每泳道上样3 μl,60 W(电压小于1700 V)电泳至二甲苯青到达凝胶底部。拆除电泳装置，冷至室温后移去上板，用滤纸粘起凝胶，表面铺保鲜膜后放入暗盒中，-20℃过夜。

六、差异条带的回收及二次扩增

将X-ray片与凝胶对齐并固定，用大头针在差异条带边缘刺孔，用一次性刀片将条带切下，放入离心管中加40 μl无菌水，盖2～3滴石蜡油，100℃煮15 min，置室温过夜。离心后将上清移至新管，冻存于-20 ℃。用相同的引物二次扩增：回收上清10 μl，10×PCR缓冲液5 μl，5 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L锚定引物2.5 μl，20 μmol/L随机引物2.5 μl，50×Taq酶1 μl，加水至50 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为94℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68℃ 2 min，20个循环。PCR产物在2%琼脂糖/EB胶电泳，切下扩增条带，用Nucleo Trap核酸纯化试剂盒(Clontech公司)回收纯化PCR产物，冻存于-20℃。

七、Northern杂交及点杂交

异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A_260nm，计算RNA含量，取15 μg RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18 S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜，80℃烤90 min。以二次PCR扩增产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm²加预杂交液(6×SSC,50%甲酰胺，1% SDS，1×Denhard试剂，150 μg/ml断裂的鲑鱼精DNA)，42℃预杂交3 h后剪开一角插入1 ml枪尖作为通道加入已100℃变性5 min的探针，42℃杂交24 h。以2×SSC，0.1% SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1% SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min 2次。膜在2×SSC中漂洗后用保鲜膜包好，放射自显影1～6天。点杂交为10 μg RNA以负压抽滤加样器点于膜上，其它同Northern杂交，两者匀以β-actin作为内参照。

八、PCR产物的克隆及测序

纯化的PCR产物按照说明书连接于pGEM-T载体(Promega公司)。用Wizard Plus SV miniprep DNA试剂盒(Promega公司)提取质粒，SacⅡ和PstⅠ双酶切鉴定阳性克隆，用fmol测序试剂盒(Promega公司)按照Sanger双脱氧法测序，以自动双向测序(赛百胜公司)验证结果。进入GenBank数据库同源性检索。

结果

我室应用倍比稀释法对肺巨细胞癌细胞系PG进行单细胞克隆，并经体内外实验鉴定(生长曲线，matrigel侵袭实验，软琼脂集落形成，裸鼠异种接种及自发性转移)，建立了两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7。在差异显示前，我室将两个亚系再一次各接种裸鼠8只，验证其转移潜能的差异：在两者均100%成瘤的情况下，BE1裸鼠体内转移率100%，而LH7无1例转移。

我室尝试差异显示30种引物组合，对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。在众多的差异基因中，一个849 bp片段在高转移亚系BE1中低表达，而在不转移亚系LH7高表达，两者差异显著，且在差异显示的重复实验中得到了验证(见图1，所用引物序列为P10∶5′-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3′；T8：5′-CATTATGCTGAGTGATA