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1凋亡抑制基因缺失的病毒在肿瘤细胞中选择性复制
现代分子肿瘤学用细胞周期学说来解释肿瘤的发生与发展。细胞增殖周期分四个阶段：G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2(DNA合成后期)、M(有丝分裂期)。细胞周期至少有两个监视点(Checkpoint)：G1/S和G2/M，它们均受p53基因控制［1］。物理(射线)、化学(药物)、生物(病毒)等不良因素刺激机体，造成DNA损伤，被损伤的DNA遇到G1/S、G2/M时，细胞周期停滞(arrest)或细胞凋亡(apoptosis)，并调动DNA修复机制校正损伤DNA。若p53等突变，则损伤DNA逾越关卡，细胞大量增殖造成癌症。
p53基因被认为是重要的肿瘤抑制基因。在多种遗传或自发突变引起的人类恶性肿瘤中，p53基因突变是至今已知的与癌症相关的最普遍的基因变化，癌症中约50%是由于p53基因突变引发的［2］。
p53基因抑制肿瘤细胞的机理与其能诱发细胞凋亡的功能相关。许多病毒基因组中也存在凋亡基因和凋亡抑制基因，且处于相对平衡状态。正是由于凋亡基因的存在，病毒才导致细胞凋亡；另一方面，正是由于凋亡抑制基因的存在，病毒在细胞中才得以复制，产生子代病毒感染周围的细胞。从整体上看，缺失凋亡抑制基因的病毒感染正常细胞仅能诱发凋亡而不能抑制凋亡，因而病毒不能复制，不会对机体造成严重危害。由于肿瘤细胞呈无限增殖状态或“凋亡抑制”状态，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的复制，因此这种病毒在肿瘤细胞内能选择性增殖，进而裂解杀死肿瘤细胞。
已发现的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirus)的E1B、单纯疱疹病毒(HSV)的ICP34.5［3］、痘病毒的CrmA、人巨细胞病毒(HCMV)的IE1、IE2、人乳头瘤病毒(HPV) E6等基因。缺失这些基因的病毒都可望用于肿瘤的生物治疗。
腺病毒的E1B55K可与p53结合并使p53失活，E1A可诱导细胞凋亡。推测缺失E1B55K但保留完整的E1A的腺病毒突变体能选择性地在肿瘤细胞中复制。
美国ONYX制药公司的Bischoff等［4］发现缺失凋亡抑制基因E1B55K的腺病毒突变体ONYX-015(d11520)能在p53突变的肿瘤细胞，如宫颈癌C33A细胞、神经胶质瘤U373细胞、胰腺癌HS7001细胞中有效增殖，细胞出现明显的CPE，最终裂解死亡。缺失病毒在人二倍体成纤维细胞中或在非p53基因突变的肿瘤细胞如直肠癌U20S细胞中不复制。为了确证这种选择性杀伤是由于E1B55K的缺失，他们将CMV启动子控制下的E1B55K表达质粒转染U20S，构建转化细胞系UFL-A，同时用载体质粒转染U20S作对照，构建细胞系U-vec，发现病毒缺失突变体d11520能完全裂解表达E1B55K的UFL-A细胞但不裂解对照细胞U-vec，而野生型腺病毒既裂解UFL-A又裂解U-vec。人结肠癌细胞RKO为非p53突变的细胞，RKOp53.13为p53突变的细胞，缺失病毒d11520在感染复数(MOI)达到1.0 PFU/cell时也不能杀死RKO细胞，但在MOI为0.01 PFU/cell时即能杀死RKOp53.13细胞，p53突变使肿瘤细胞对凋亡抑制基因缺失病毒的敏感性至少提高100倍。将d11520注入C33A宫颈癌细胞建立的荷瘤裸鼠模型内，发现所有肿块尺寸均显著减小，60%(3/5；12/18)的实验肿瘤完全消退，观察3个月未见复发。为确证C33A肿块尺寸减小或肿瘤消退是由d11520病毒复制引起，分析了肿瘤切片的腺病毒5型(Ad5)衣壳蛋白，用Ad5六邻体(hexon)蛋白的单抗进行的免疫组化染色结果表明d11520病毒在整个C33A肿瘤内复制并传播。用非p53基因突变的肿瘤细胞建立的肿瘤模型中未得到同样结果。如辅以常规化疗药物，则d11520的杀瘤效应更强［5］。
1997年文献报道用d11520作的一期临床试验结果：32例受试头颈癌患者中，12例肿瘤明显减小，减小幅度可达90%，未发现任何毒副作用。用其他肿瘤进行的安全性实验和头颈癌进行的二期临床试验正在进行之中［6］。1998年，Duque［7］报道：缺失整个E1B区，包括E1B55K和E1B19K基因的腺病毒突变体H5d1118也有选择性杀瘤功效，甚至比野生型病毒更有效、更快速地杀死表皮癌A431细胞、结肠癌HT-29细胞、直肠癌SAOS2细胞等肿瘤细胞，推测肿瘤细胞的死亡除了病毒复制裂解引起的坏死外，还有E1A诱导的凋亡。
Ad5 E4的ORF6也参与p53失活，作者认为构建E1B 55K和E4 ORF6双缺重组腺病毒也许能更有效地选择性杀瘤。以上研究证明凋亡抑制基因缺失的腺病毒可以用于肿瘤的生物治疗。其主要问题是人体对腺病毒的免疫反应可能限制了病毒的传播和多次使用。但如果限于局部注射，这种免疫反应也许可以激活人体的抗肿瘤免疫。主要抗原基因的缺失是否会降低免疫反应而不影响选择性杀瘤效应也值得进一步探索。
在缺陷型腺病毒治疗肿瘤的研究进展同时，缺陷型单纯疱疹病毒的研究也正在进行。缺陷型单纯疱疹病毒不同于缺陷型腺病毒的独到之处在于：
(1)HSV基因组较大(152 kb)，序列结构已经清楚，大约70个基因可被代替而仍能在某些细胞中复制，因而插入外源基因的容量可达30 kb以上，为提高治癌效率，可再方便地插入细胞因子基因，重组病毒也容易包装；
(2)工程HSV感染肿瘤细胞后，在其中复制并杀死肿瘤细胞，但在正常细胞中不会复制。为避免其潜在性危害，可以利用GCV、ACV进行治疗，以便临床试验时对病毒进行有效控制；
(3)HSV宿主范围较宽，包括非分裂细胞，可以说它感染迄今研究过的所有类型的脊椎动物细胞。缺失病毒可望用于多种肿瘤的治疗；
(4)有报道证明，ICP34.5基因是神经毒力基因，因此缺失ICP34.5基因的HSV无神经毒性。
作者构建了缺失凋亡抑制基因ICP34.5基因并带LacZ报道基因的单纯疱疹病毒，它能选择性地在星型胶质瘤U251等肿瘤细胞中复制。缺陷型HSV带LacZ报道基因，重组病毒感染复制表达后在X-Gal存在下呈蓝色，便于筛选以及病理学切片分析。
2携带艾滋病毒受体的重组病毒选择性杀死艾滋病毒
艾滋病毒(HIV)侵入细胞主要通过其包膜蛋白，包膜蛋白gp120与靶细胞表面特异性受体结合是HIV感染的关键一步。靶细胞表面受体主要为CD4糖蛋白，CD4糖蛋白位于T淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、小神经胶质细胞等细胞的表面。CD4分子43位苯丙氨酸插入gp120“深腔”(deep cavity)，CD4的59位精氨酸与gp120的368位天冬氨酸形成盐桥，辅以主链原子间的氢键而促成CD4与gp120的结合。这一结合又激活跨膜蛋白gp41，gp41外侧结构域(ectodomain)的三聚卷曲螺旋在病毒膜与细胞膜间架起桥梁，导致病毒膜与细胞膜融合，最后病毒突破细胞屏障，将遗传信息携入细胞，而后逆转录，整合，基因表达，病毒复制，装配，病毒粒子释放，形成次级感染［8，9］。
最新研究结果表明，HIV进入靶细胞，除了需要靶细胞表面受体CD4外，还必需另外一类趋化因子受体(chemokine receptors)作为辅助受体(coreceptor)。病毒毒株不同，所需要的辅助受体不同。嗜T淋巴细胞的HIV株需要CXCR4，嗜巨噬细胞的HIV株需要CCR5，其他HIV株需要CCR2b或CCR3。CD4与gp120包膜蛋白的结合诱导gp120构象改变，促成gp120上与辅助受体结合的位点暴露或形成。gp120 V3区loop是CCR5的结合位点，V3缺失突变或使用抗V3 loop的抗体均可影响gp120与CCR5结合。gp120中还有一段高度保守的序列对CCR5结合至关重要，这段序列是直接与辅助受体结合，还是通过促进V3构象改变而起作用目前仍不清楚。辅助受体的发现是HIV研究中的重要突破［8，9］。
综上所述，HIV的gp120/gp41与靶细胞表面受体CD4/CXCR4或CD4/CCR5的结合决定了病毒膜与细胞膜的融合。从物理学上看，若CD4/CXCR4在病毒膜上，gp120/gp41在细胞膜上，病毒膜与细胞膜的融合也是可能的。HIV感染细胞后、芽生出新的病毒粒子前，gp120/gp41表达在感染细胞表面。若研究者能够构建出一个外膜上带有CD4/CXCR4的重组病毒，则这种病毒的膜会与被HIV感染的细胞的膜融合，随后进入HIV感染细胞造成病变，最终杀死HIV感染细胞。
Mebatsiona［10］等构建了重组狂犬病毒(RV)，RV表面糖蛋白G缺损，仅保留G蛋白胞内尾巴(tail)，但带有CD4的跨膜锚定区/CXCR4的膜外区7。重组狂犬病毒选择性地感染表达HIV gp120/gp41的啮齿动物和人的细胞，CXCR4和CD4足以支持gp120/gp41介导的融合。本研究中的重组病毒只能进行一轮感染，虽然重组病毒能够感染膜上有HIV gp120/gp41的细胞，但不能在该细胞中表达出完整的G蛋白或完整的CD4/CXCR4蛋白，没有包膜蛋白，不能包装出新的病毒粒子。
Rose等［11］构建了重组水疱性口炎病毒(VSV)，它能选择性地感染HIV感染细胞，并可在其内复制。VSV中包膜糖蛋白G的作用是识别靶细胞并促成病毒膜与细胞膜的融合。重组病毒VSV△G-CC4完全缺失G基因，代之以完整的CD4和CXCR4基因，它不能感染正常细胞，但可以在稳定表达G蛋白的细胞系中增殖，病毒粒子外膜为CD4/CXCR4。在实验中，首先用HIV-1感染T淋巴细胞系Jurkat或H9T，3～5天后，免疫荧光电镜分
