目的 建立抗肿瘤转基因小鼠模型。方法 用BamHI酶切表达质粒pULB3238获取小鼠细小病毒非结构基因，通过显微注射法将其接种入小鼠受精卵内制备转基因小鼠。转基因鼠尾部组织DNA以PCR检测靶基因整合；整合转基因的G₀A6小鼠与正常C57BL/6J小鼠配种所产G₁代转基因鼠，通过RT-PCR检测目的基因在其肺脏等组织的转录；G₁代鼠根据PCR检测结果分整合和未整合非结构基因两组，两组均腹腔注射致肺肿瘤化学致癌剂氨基甲酸乙酯水溶液。结果 G₀代有4只鼠整合靶基因；G₁代(G₀A6子代)转基因鼠的肺组织有靶基因转录；G₁代整合转基因实验组小鼠被诱导肺瘤结节平均数显著少于未整合转基因的对照组(P＜0.01)。结论 抗肺肿瘤转基因小鼠模型已建立。

FOUNDING OF TRANSGENIC MICE MODEL FOR ANTI-LUNG-TUMORIGENESIS

Yang Youwen^1△ Shen Xizhong¹，Zhang Weihua²,Chong Xiaoqian³.Xiao Shudong¹.

¹Shanghai Institute of Intestinal Disease,Renji Hosptial,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200001;²Department of Genetic Epidemiology,School of Public Health,Shanghai Medical University;³Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences；^△Present address:Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054

Objective：To produce transgenic mice model for antitumorigenesis.Methods：Foundtransgenic mice carrying parvovirus minute virus of mice(MVM)non-structure (NS)gene by microinjecting the gene that contained the MMTV-LTR promoter and MVM NSgene.Transgenic mice were identified by subjecting tail DNA to amplification bypolymerase chain reaction using a set of oligonucleotides as primers.The MVM NSgene transcript was proved by RT-PCR.Urethane water solution was administered by intraperitoneal injection to induce lung tumor nodes in the offspring of G₀ A6，in which the MVM NS gene is transcribed in the lung of the transgenic mice.Results：There were four mice carrying MVM NS gene in G₀ generation.The MVM NS genewas transcribed in the transgenic offspring lung of G₀A6.The average number of lung tumor nodes was significantly lower in mice group carrying MVM NS gene thanMVM NS gene free group (P＜0.01).Conclusion：Anti-lung-tumorigenesis model hadbeen established.

Key words Parvovirus minute virus of mice Non-structure gene Transgenic mice Anti-lung-tumorigenesis model

小鼠细小病毒(parvovirus minute virus of mice,MVM)基因组为单链线状DNA，大约5 kb，存在两个开放阅读框，一个编码衣壳蛋白，另一个编码非结构(non-structure,NS)蛋白。MVM不仅具有选择性抑制转化细胞和肿瘤细胞生长的特性，而且能够降低人和动物的肿瘤自然发生率，抑制化学和生物致癌剂“诱发”动物肿瘤形成^［1］。近来资料表明MVM NS基因是MVM抗肿瘤的重要组成部分，一方面参与促进病毒自身基因的复制和表达，另一方面对转化细胞和肿瘤细胞具有直接细胞毒性，而对正常细胞却未有可检测到的毒害作用^［2］。目前对MVM NS抗肿瘤的机制仍未弄清。

转基因动物技术具有在基因及细胞水平操作，组织及动物整体表达的特点。利用该技术可以在活体内从不同时间和不同空间的四维角度深入探讨基因的活动规律及表型效应，同时为人类疾病防治研究开辟全新而有效的途径^［3］。

鉴于转基因小鼠模型在多种病毒，如HBV、HIV等的致病机制研究中得到成功应用^［4，5］。为在个体水平上探讨MVM NS基因抗肿瘤的作用和机制，本研究将MVM NS基因导入小鼠受精卵，以期建立抗肿瘤的MVM NS基因转基因小鼠模型。

材料和方法

1.实验动物 F1代杂交鼠(SJL×C57BL/6)由中国科学院上海细胞生物学研究所实验动物中心提供。工具酶均购自Promega公司。生化试剂均为国产分析纯。表达性质粒pULB3238由德国Heideberg大学应用病毒研究所J.Rommelaere教授馈赠，含MVM的非结构基因(NSG)，其启动子为MMTV-LTR(图1)。

图1 pULB 3238质粒图谱

2.靶基因的纯化与鉴定 Bam H1酶切表达质粒pULB3238，低熔点凝胶分离长5.7 kb的MVM NS基因(含启动子MMTV-LTR)，酚/氯仿常规抽提，然后按文献^［6］氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化，TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.1 mmol/L EDTA)透析，调整浓度至2 μg/ml左右。

3.前核显微注射法将待转基因导入受精卵细胞^［7］用显微注射法将待转基因注入受精卵雄性前核中，注入量为1～2 pl/卵，然后移植到6周龄假孕母鼠的输卵管中，每只25枚左右，待其发育后产仔。

4.转基因鼠的检测鉴定

(1)转基因鼠MVM NS基因整合的检测(PCR) 当仔鼠生长至4周左右，剪下长约0.5 cm的鼠尾，剪碎，经蛋白酶K/酚/氯仿法抽提纯化，溶于50 μl水中，取2 μl作为PCR模板。在MVM NS基因外显子区，设计一对PCR引物，3′：TGATGGCTCAAC CAGGTGGA；5′：TGGTGTGCTCCAAGGCTCTA。PCR反应体积为50 μl，dNTPs浓度100 μmol/L，引物浓度1 μmol/L，DNA聚合酶2 U。将PCR反应各液体混合后95 ℃变性5 min，然后按95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s，进行35个热循环，最后72 ℃延伸10 min。反应产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

(2)转基因鼠MVM NS基因转录的检测(RT-PCR) 在无菌环境下摘取G₀A6子鼠的肺、乳腺、颌下腺、胃、小肠、脑等组织，去掉胃、小肠内容物，以生理盐水冲洗净，置液氮中保存。临用时取出置碾钵加液氮碾成细粉，异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法抽取总RNA，无RNase的DNase去除残余DNA。然后以AMV反转录酶合成cDNA第一链，以cDNA为模板进行PCR，其条件同4(1)。

5.氨基甲酸乙酯诱发小鼠肺瘤结节^［8］

选取4～6周龄的G₀A6子代健康小鼠41只，其中19只整合MVM NS基因，为实验组小鼠，22只未整合靶基因，为对照组小鼠。按10 μl/g 体重腹腔注射10%的氨基甲酸乙酯水溶液，每周1次，共10次。停药后20周脱臼处死小鼠，取肺脏，解剖镜下计肺瘤结节数。

6.转基因小鼠抗肺肿瘤作用的评价^［9］

结果

1.转基因小鼠的制备

共注射受精卵720枚，培养存活500枚，存活率近70%(500/720)，选取225枚植入9只假孕母鼠输卵管中，其中4只产仔，怀孕率约44%(4/9)，共产14只，出生率约6%(14/225)。

2.靶基因整合的分析

14只G₀代鼠基因组DNA经PCR扩增，G₀A2、G₀A6、G₀A13和G₀A14等4只出现特异性基因扩增条带(908 bp)(图2A)。以³²P标记的特异性MVM NS基因作为探针对PCR产物进行Southern blot，其阳性率与PCR结果一致(结果未示)。说明4只(约28.5%)G₀代鼠确有靶基因的整合。

3.G₁代转基因小鼠的获得

将G₀A2、G₀A6、G₀A13和G₀A14整合转基因鼠与正常的C57BL/6J小鼠配种后，均产仔鼠。经PCR-Southern blot检测，均能将整合的外源基因传给后代。共产G₁代鼠153只，其中73只(47.7%)带有靶基因。图2B示部分带有转基因的G₁代鼠(G₀A6子代)PCR检测的结果。

图2 G₀代和G₁代转基因鼠DNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

A：G₀代A1～A14鼠DNA PCR扩增带。B：部分带有转基因的G₁代鼠(G₀A6子代)DNA PCR 扩增带。M：Low DNA Mass^TMLadder(从上到下带示2 000 bp、1 200 bp、800 bp、400 bp)。

4.转基因的转录分析

分别取整合靶基因G₁代(G₀A6子代)鼠的肺脏、乳腺、颌下腺、胃、脑等组织，提取总RNA后进行RT-PCR，检测外源基因是否转录。结果在G₀A6子代鼠的肺脏