p53基因与胃癌的关系早已引起人们的关注^［1］，人胃癌发生中有野生型p53基因的缺失或突变，该基因可启动细胞凋亡(apoptosis)^［2，3］。全反式维甲酸(all trans-retinoic acid, ATRA，ATRA，以下简称RA)可诱导胃癌细胞分化^［4］。作者曾发现RA和叶酸(folic acid, FA)能部分诱导人胃癌细胞凋亡^［5］，但其机理尚未明了。本研究的目的即探讨两者影响凋亡的机制和途径。

材料与方法

1.实验材料MKN-45低分化人胃癌细胞株系上海瑞金医院馈赠，RPMI-1640、10%的胎牛血清、L-谷氨酰胺和RNA抽提试剂盒均购自Gibco公司。N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙碘酸(HEPES)、RA和FA及DNA酶Ⅰ产于Sigma公司。α-³²P dCTP随机引物试剂盒为Pharmacia公司产品，野生型p53 cDNA探针(1.8 kb)和原位DNA断段切口标记(TUNEL)试剂盒购自华美公司。

2.方法细胞培养与干预：细胞在含有5% CO₂、95%空气中，37℃的潮湿70 cm²的玻瓶中培养(培养液15 ml)。RA的工作浓度10^-6(低浓度RA组，LR)和10^-5 mol/L(高浓度RA组，HR)。FA贮存液浓度为0.4 g/L，工作时以培养液稀释为2×10^-33 g/L(低浓度FA，LF)和10^-2 g/L(高浓度FA，HF)，对照组未经任何处理。培养72 h后收集瓶中细胞。用于TUNEL者培养在含有玻片的48 cm²平皿中(培养液10 ml)；RNA抽提和Northern blot：RNA抽提试剂盒(Trizol)，按1 ml/10 cm²培养细胞比例溶解贴壁之细胞；以移液管吹打后将溶解产物移至1.5 ml之微量离心管中，15℃～30℃温育5 min，按0.2 ml/ml Trizol比例加氯仿，匀之及同样温育2 min，低温离心15 min、12000g；吸取水相，加异丙醇及再离心析出RNA，在含有1 μg/ml的溴乙啶的1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，虹吸转膜；随机引物法标记探针，预杂交和杂交，洗膜；-70℃放射自显影4天，读片分析。

3.TUNEL应用RA干预完成后，取粘满细胞的玻片，空气中干燥，并先后浸泡在12%的中性甲醛和75%乙醇溶液中固定；按试剂盒说明并稍加改良操作；先后以dUTP、TdT37℃温育2 h，PBS冲洗后以封闭液和亲和素-辣根过氧化酶处理，并再次37℃温育1 h；DAB染色及苏木素复染和脱水、透明与封片；300～600倍光镜下检测。在玻片上任选5～10个视野，计数被DAB染成棕黄色的细胞数，以百分数表示之。阳性对照系在以下TdT处理前先经1.0 μg/50 μl的DNA酶Ⅰ温育20 min；阴性对照者不经TdT处理。

结果

1.人胃癌细胞系MKN-45有野生型p53基因mRNA的表达(如图1)。

2.FA对p53基因的表达无大的影响。

3.高浓度的RA可提高p53基因mRNA的表达水平(如图1)。

1MKN-45细胞野生型p53基因mRNA的Northern blot. Lane 1,2,3,4,5分别为对照组、LF组、HF组、LR组和HR组；HR处理者mRNA表达明显高于其他组。

4.TUNEL方法的结果：在以LR或HR处理的MKN-45细胞系中，凋亡小体数目明显增多，而低浓度者尤甚(见插页2图1)；其胞浆内空泡样变并出现嗜碱性的凋亡小体。凋亡指数(%)对照组3.87±2.59，HR组6.99±1.63，LR组为10.70±5.97最高，对照组与LR，HR之比较P＜0.05具有统计学显著意义。

图1MKN-45细胞系被LR(A)，HR(B)干预后的凋亡情况，(C)为对照组，箭头示凋亡 细胞

讨论

野生型p53基因作为一抑癌基因广泛存在于正常组织细胞中^［6］，在胃癌等恶性肿瘤中常发生突变。同时也是细胞凋亡的诱导基因^［2，3］。有关野生型p53基因的mRNA表达研究和p53在各种肿瘤细胞凋亡中作用已有多篇报道。Gotlieb氏发现^［7］，TNFα诱导卵巢癌凋亡的同时野生型p53基因表达增强，认为前者正是通过后者而发挥作用的。在人卵巢细胞系3AO和AO中，孕酮可诱发细胞凋亡和野生型p53基因表达，且该凋亡的发生与p53基因表达的增加有关^［8］。

RA是一组天然存在的与维生素A分子结构相似的物质，可同时诱导HL-60细胞^［9］和肝癌细胞的分化和凋亡^［10］。FA是一种水溶性维生素，可抑制结肠粘膜上皮细胞的增生而抗结肠癌^［11］。两者与癌基因或抑癌基因表达的关系的研究尚不多见。

有人曾对人结肠癌细胞的凋亡和p53基因表达进行研究^［12］，发现以¹³⁷Cs-γ射线照射后，原有野生型p53基因表达的V411细胞系，p53基因的mRNA表达增强伴有细胞凋亡的增加；而原无野生型p53基因的表达的SW480细胞系，不出现p53基因的mRNA表达和细胞凋亡的变化。因此，本研究显示RA可提高MKN-45细胞系的p53基因mRNA表达水平，尚需进行深入研究。

细胞凋亡的发生不仅仅归因于野生型p53基因的表达，往往需要活化的fas基因^［13］。本实验中不同浓度RA对凋亡的影响与p53基因表达的影响不一致，也说明要完全弄清RA等影响细胞凋亡和抗癌的机理，应观察多种基因的变化。

本课题承蒙卫生部科学基金资助(批准号：96-1-329)

第一作者简介房静远，男，医学博士，副教授。

参考文献

1房静远，江绍基. p53基因与胃癌. 国外医学消化系疾病分册, 1994, 14:204

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(收稿：1998-03-02修回：1998-06-26)