目的研究B7分子与免疫因子之间的协同作用，探索非免疫原性肿瘤的免疫基因治疗。方法将B7-1基因导入非免疫原性肿瘤细胞B16，在mRNA和蛋白质水平证实B7的表达后，首先体外观察B7分子、抗CD3单克隆抗体(抗CD3 mAb)和白细胞介素2(IL-2)对小鼠脾淋巴细胞激活的协同作用。结果活肿瘤细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞的反应性优于灭活肿瘤细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞的反应性。免疫3周的小鼠脾淋巴细胞的反应性优于免疫1周的小鼠脾淋巴细胞的反应性。在抗CD3 mAb和IL-2单独或联合存在下，B7⁺B16比B7^-B16诱导明显增强小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论抗CD3 mAb和IL-2可与非免疫原性肿瘤细胞表面表达的B7分子协同激活荷瘤小鼠的脾淋巴细胞。

ACTIVATION OF MURINE SPLEEN LYMPHOCYTES

SYNERGISTICALLY INDUCED BY B7 CONSTIMULATORY

MOLECULE AND IMMUNOLOGICAL FACTORS

Zheng Zhuling,Zhang Zhuren,Wang Dongmei，et al.

Research Center,Captial Univerity of Medical Sciences,Beijing 100054；Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sicences,

Peking Union Medical College,Beijing 100021

Objective：Activation of murine spleen lympyocytes synergistically induced by B7 molecules and immunological factors was studied to explore immuno-gene therapy of nonimmunogenic tumor.Methods：Nonimmunogenic tumor cells B16 were transfected with murine B7-1 cDNA and expressed B7 at the level of mRNA and protein.First the synergistical role of B7 molecule,anti-CD3 monoclonal antibody (mAb) and interleukin-2(IL-2) was observed in vitro for inducing the activation of murine spleen lymphocytes.Results：The responsibility of spleen lymphocytes from mice immunized by alive tumor cells was better than that from mice immunized by inactivated tumor cells.The responsibility of spleen lymphocytes from mice immunized for 3 weeks was better than that from mice immunized for 1 week.At the present of IL-2 and/or anti-CD3 mAb,B7⁺B16 as antigen-presenting cells induced much stronger proliferation of murine spleen lymphocytes than B7^-B16 did.Conclusion：B7 costimulatory molecules expressed on nonimmunogenic tumor cells B16, anti-CD3 mAb and IL-2 could synergistically induce the activation of murine spleen lymphocytes.This result could benefit further study.

Key wordsB7-1Anti-CD3 mAbIL-2Nonimmunogenic tumor

目前已经证实除了抗原特异性信号之外，共刺激信号也是T细胞激活过程中必不可少的重要信号。共刺激信号的传递是由抗原递呈细胞上的共刺激分子来完成的。目前研究众多的是B7分子。据报道B7导入免疫原性的肿瘤细胞可使之在体内的致瘤能力降低，并诱发全身性的免疫反应，但将B7导入非免疫原性的肿瘤细胞却不能诱发抗肿瘤免疫^［1］。为了探索非免疫原性肿瘤的免疫基因治疗问题，本研究选择高度恶性的非免疫原性肿瘤细胞B16，导入B7基因并联合应用抗CD3单克隆抗体(抗CD3 mAb)和白细胞介素2(IL-2)，观察免疫因子协同B7⁺B16体外激活小鼠脾淋巴细胞的作用，为进一步的研究提供基础。

材料与方法

1.细胞培养C57BL/6小鼠来源的黑素瘤细胞(H-2^b)B16(本室冻存)及其病毒转染细胞、ψ₂包装细胞等均在含10%胎牛血清和100 μg/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640中培养。

2.质粒DNA制备逆转录病毒载体pLNSXmB7携带小鼠B7-1 cDNA(mB7)，pLXSN不含mB7，为对照载体，两者均具有氨苄青霉素和新霉素抗体。质粒由美国Lieping Chen博士惠赠。按《分子克隆》第二版，氯化钙法制备XL1-blue(本室冻存)感受态细胞，然后进行质粒DNA的转化、制备与鉴定。

3.逆转录病毒的包装、滴度测定和病毒感染肿瘤细胞用lipofectin(GIBCO BRL产品)将逆转录病毒载体DNA导入ψ₂包装细胞系，筛选高滴度病毒分泌克隆，收集ψ₂培养上清感染肿瘤细胞。待感染的细胞按10⁵细胞密度传代，感染时加入病毒上清和聚凝胺(终浓度8 μg/ml，Sigma产品)，37℃温育2～3 h，然后加入新鲜培养液，37℃培养48 h，细胞传代并加入含G418(GIBCO BRL产品)1 mg/ml的选择培养基，每3～4天换液一次直至抗性克隆出现。

4.细胞表面标志的测定胰酶消化细胞，加入融合蛋白CTLA-4 Ig(美国Linsely博士惠赠)或对照无交抗体，4℃ 1 h，PBS冲洗，细胞沉淀加入对应的FITC标记抗体(Jackson Immuno.Research Lab产品)，4℃ 0.5～1 h，PBS冲洗后，用流式细胞仪(Becton Dickinson产品)分析细胞表面B7分子的表达。

5.细胞总RNA制备肿瘤细胞总RNA提取采用异硫氰酶胍-酚-氯仿抽提“一步法”^［2］。

6.RT-PCR反应按试剂盒(Perkin Elmer产品)说明进行。小鼠B7胞外区基因PCR引物，由北京赛百盛生物工程公司合成。

5′端引物CAACGCGTATGCAGTGAAAGATAAGGT

3′端引物GTATAGTCGACCCAGGTAAAGTCC

7.混合淋巴细胞-肿瘤细胞培养(MLTC)反应肿瘤细胞加丝裂霉素C(MCC)至终浓度130 μg/ml，37℃ 5% CO₂温育1～2 h，大量生理盐水洗涤后，调成适当浓度，作为刺激细胞(S)。B7⁺B16活细胞2×10⁵/只、MMC处理的B7⁺B16(称为MMC B7⁺B16)3×10⁵/只免疫小鼠(C57BL/6，购自本所动物室)。分别在第1周、第3周断颈处死已免疫的小鼠，无菌取脾，100目钢网研磨成单细胞，低渗裂解红细胞后，用含5%FBS的培养基调成适当浓度作为反应细胞(R)。在96孔平底微量细胞培养板中，每孔加入2×10⁵的反应细胞和不同比例的刺激细胞，以及IL-2(终浓度1000 U/ml)或/和抗CD3 mAb(终浓度100 ng/ml),37℃ 5% CO₂条件下培养72 h，结束培养前18 h每孔加入³H-TdR 1 μCi，培养结束，回收细胞，干燥后加闪烁液，β-液体闪烁计数仪测定cpm值。

8.统计学处理采用student t检验。

结果

一、B7基因转导以及B7基因表达的鉴定

1.B7基因转导在lipofectin的介导下，将质粒pLNSXmB7与pLXSN分别导入ψ₂包装细胞系，经G418筛选10～14天，出现阳性克隆，测定培养上清病毒滴度＞10⁶ CFU/ml。用含假病毒颗粒的ψ₂培养上清感染B16，经G418筛选，10～14天长出细胞克隆。

2.在蛋白质水平鉴定B7基因的表达经FACS分析，在pLNSXmB7转染的G418抗性细胞克隆中，获得B7稳定表达的细胞克隆，称为B7⁺B16；用同样方法分析pLXSN转染的G418抗性细胞克隆，细胞表面未检测到B7分子的表达(图1)，称为B7^-B16。

3.在mRNA水平鉴定B7基因的表达提取细胞总RNA，经RT-PCR，扩增mB7胞外区基因片段(594 bp)。B7⁺B16细胞的PCR产物长度与预计长度一致(图略)。

1细胞表面B7基因表达的鉴定

二、在MLTC反应中IL-2、抗CD3 mAb与B7⁺B16的协同作用

用分别经B7⁺B16活细胞和MMC B7⁺ B16细胞免疫的两种小鼠脾淋巴细胞作为反应细胞进行MLTC。

(1)在不同肿瘤细胞与脾淋巴细胞数的比例下，B7⁺B16表现出比B7^-B16更强的促增殖作用(P＜0.01)，选择S∶R=1∶20的比例进行以下实验(图2A)。

(2)在抗CD3 mAb、IL-2分别存在下，B7⁺B16比B7^-B16诱导更强的小鼠脾淋巴细胞的增殖反应(P＜0.01)。当抗CD3 mAb与IL-2同时存在下，B7⁺B16诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的作用明显增强，表现出两种免疫因子与B7分子的明显协同作用，与单种免疫因子存在时相比较P＜0.01(图2B)。

图2用B7⁺B16活细胞免疫小鼠(1)或用MMC预处理的B7⁺B16细胞免疫小鼠；(2)3周后，分别取小鼠脾淋巴细胞，分别加入不同的刺激细胞，然后进行MLTC实验。(A)在不同的肿瘤细胞/脾淋巴细胞(S/R)比例下进行MLTC实验。(B)反应体系中加入不同的免疫因子，在S/R=1∶20下进行MLTC实验。

(3)MMC B7⁺B16免疫小鼠3周的脾淋巴细胞的反应性要比免疫小鼠1周的脾淋巴细胞的反应性好，这是表明B7⁺B16小鼠脾淋巴细胞的致敏需要一定的时间。用MMC B7⁺B16免疫小