白血病是一组高度异质性的疾病，目前临床联合化疗的方案过于固定，不能针对不同患者选择相应方案，而且治疗白血病的化疗药大多具有较大的毒性，往往当临床确定患者对应用的药物不敏感时，药物已产生了严重的毒副作用，有的已导致耐药基因(MDR1)产生。因此自从50年代以来，已先后建立了多种体外药敏试验法，如核酸前体掺入法、集落形成法、区别染色细胞毒法(DiSC)、四氮唑盐法(MTT法)和荧光测定微培养细胞毒试验(FMCA)等，试图摆脱“菜谱式(cookbook)”治疗，而建立“量体裁衣式(tailor)”的治疗。其中MTT法是一种近年研究较广泛的方法。它是在1983年由Mosmann首先应用于鼠淋巴瘤细胞系中研究IL-2等细胞因子对细胞存活和增殖的影响^［1］。MTT法原理是活细胞特别是增殖期细胞，脱氢酶通过线粒体能量代谢，将MTT还原成可显色的甲月替(formazan)，甲月替的形成量与细胞活力成正比，因此药物对肿瘤细胞活力的影响(即杀伤程度)，可显色定量。MTT法适合于急性白血病药敏试验的客观优势为：①急性白血病细胞离体后所处环境与体内较相似；②临床已有较多的白血病化疗药物供选择；③标本取材方便，治疗不同阶段能取得有代表性的试验标本作跟踪研究；④临床疗效易于判断，易获得临床相关性资料^［2］。本文结合最新研究进展，就MTT法在白血病的体外药物敏感性、耐药性和预后判断等方面的应用及目前存在的问题作一详尽的综述。

1.在体外药物敏感性中的应用

MTT法可同时检测白血病细胞对20多种药物的体外敏感性，因此很有利于筛选敏感的抗癌药。Hongo^［3］研究了41例白血病标本对26种药物反应的比较，由于临床多数病人均为联合用药而单药治疗很少，因此他评价体外/体内关系的标准为真阳性(体外/体内均敏感，S/S)，使用2种以上体外敏感药物获完全缓解(CR)或使用一种体外敏感药物有部分反应(PR)；真阴性(体外/体内均耐药，R/R)，仅使用体外不敏感药物获CR或PR；假阳性(S/R)，使用2种或2种以上体外敏感药而未达CR或PR；假阴性(R/S)：仅使用体外不敏感药物获CR或PR，获得了74.4%的预测准确率。通过对不同稀释浓度的药物的CI分析，得出氨甲喋呤(MTX)、强的松(PDN)、长春新碱+强的松(VCR+PDN)为非剂量依赖。Pieters^［4］在82例儿童急淋(ALL)中也发现PDN的剂量依赖性差别很大，根据白血病细胞存活下降50%时的药物浓度(LC₅₀)可将患者大致分2组，一组为敏感组而另一组为耐药组。发现B细胞ALL(B-ALL)病人细胞体外对柔红霉素(DNR)、VCR、PDN耐药而对烷化剂敏感，为临床上B-ALL用烷化剂治疗提供了实验依据。另外解释了仅在极少数病例中检测到MTX的细胞毒性，可能是因为死亡细胞释放高浓度的核苷酸导致活细胞中嘌呤、嘧啶代谢的补救通路的作用增加，而阻止进一步的杀伤，致体外细胞杀伤减弱。Pieters^［5］在其研究中甚至发现PDN体外可刺激ALL细胞的生长。Klumper^［6］发现ANLL体外对糖皮质激素和VCR均比ALL耐药，这与临床这两种药物主要用于ALL相符。通过实验，发现大剂量阿糖胞苷(AraC)联合米托蒽醌(Mit)可能是复发或难治儿童ANLL的一个有效方案。Kaspers^［7］比较了Mit、DNR和阿霉素(DOX)的体外细胞毒性。由于DOX、DNR对心脏毒性很大，因此需要一个替代品，研究发现除了T细胞ALL(T-ALL)比普通ALL(c-ALL)或前BALL(preB-ALL)对DNR、DOX更耐药外，这三种药物的抗白血病活性无显著差别。属蒽醌类的Mit与蒽环类作用相似，在有些动物实验中发现无心脏毒性，已有的临床资料也显示Mit抗白血病活性与蒽环类相似甚至更高，对心脏毒性也低于蒽环类。可见体外药敏试验可以作为筛选同类药物中毒性较小药物的实验依据。MTT法也可以作为研究药物体外相互作用的手段，因为临床上很难鉴定药物的相互作用。Kaspers^［8］研究了PDN+VCR、PDN+MAF(mafosfamide)、PDN+DNR三种配伍的各自的相互作用，定义协同作用为测得的白血病细胞存活率(Leukemia Cell Survival,LCS):LCS(A+B)＜LCS(A)×LCS(B)；相加作用为LCS(A)×LCS(B)＜测得LCS(A+B)＜LCS(Dmax)；拮抗作用：测得LCS(A+B)＞LCS(Dmax),Dmax即为活力最大的药物。发现PDN与VCR、MAF的协同作用大于DNR，而PDN与DNR的拮抗作用大于VCR、MAF。虽然体外药物的剂量和时间并不能代表临床状态，体外也可能发生化学性的相互作用，但体外联合用药试验有其优于单药试验的方面，因为若存在拮抗作用将导致假阳性，而协同作用则导致假阴性。Carmichael^［9］认为MTT法在细胞株中可用于新药筛选。

2.在耐药性研究中的应用

热点集中在耐药修饰剂(RMs)逆转耐药方面的研究。Lambert^［10］尝试在新鲜白血病标本中以MTT法研究了异搏定(VRP)、环孢素A(CsA)和利尿酸(EA)这三种RMs在逆转DOX、VCR、阿克拉霉素(ACL)及马法兰(MEL)耐药中的作用。结果显示加入RMs后白血病细胞对上述药物敏感性升高2倍的仅占少数，而慢淋(CLL)标本中使用VRP或CsA可使细胞对VCR的敏感性明显升高，VRP或CsA对ACL无影响。VRP、EA对MEL也没作用。但该实验中所用RMs剂量均比体外细胞株研究中低得多。本实验支持在耐药白血病人中用DOX或VCR的同时加用VRP或CsA的观点。研究表明，对DOX或VCR越耐药，RMs的作用则越大。但由于Pgp在正常组织包括正常造血干细胞也有表达^［11］，这些因素的掺入使RMs在临床的应用复杂化。另外发现DOX与ACL之间不存在交叉耐药，因此可以用ACL替代治疗DOX耐药的患者。作者认为仅用MTT法作为患者是否选择用RMs是不成熟的，但可参与类似研究的前瞻性临床试验，包括Pgp表达水平和mdrl、mdr3基因的检测等技术。由于RMs对正常细胞有副作用，因此不能常规应用，而且加入RMs后的可能结果很难预测，因此MTT试验在临床试验中有一定的意义。Baines^［12］比较了白血病细胞与正常造血细胞对DNR的敏感性，发现复发或难治AML病人原始细胞IC₅₀并不升高，p170阳性细胞也并不增多，而经DOX诱导缓解后的骨髓中的单个核细胞比正常骨髓中的单个核细胞对DNR更耐药，对CsA反应也更佳，这意味着再生过程增强了骨髓细胞的耐药性，可以解释为何难治患者经强化疗后MDR-1 mRNA水平明显升高。

耐药是复发、难治儿童ALL预后差的一个重要因素，但何时、对何种药物产生耐药及耐药程度尚不清楚。Klumper^［13］通过对141例初发ALL和137例复发ALL儿童中检测了13种药物的体外耐药，发现复发者对糖皮质激素和地塞米松(DX)耐药分别为初发者的357倍和＞24倍，而对VCR、AraC、环磷酰胺(CTX)及鬼臼类则无耐药性。因此提出复发ALL可以用不易产生耐药的药物，并报道了Ara C+鬼臼类在晚期复发者中治疗的有效性。MTT法也可用于交叉耐药的研究。Maung^［14］发现DNR的ID₅₀是一个有用的指标，同时可预测体外对Mit、VP16、MEL的耐药，而MEL耐药同时可预测DNR、Mit、VP16的耐药，显示交叉耐药现象。Maung^［15］同时进行MTT试验与谷胱甘肽(GSH)水平的检测，显示体外对DNR、MEL和PDN敏感性与GSH水平呈显著正相关，化疗无反应者GSH水平明显高于反应者。而GSH水平升高被认为是多药耐药机制之一。Sparrow^［16］通过流式细胞仪用Pgp特异的单克隆抗体检测Pgp表达水平，用MTT法检测了体外对VCR和DOX的耐药性，发现两者具有良好的相关性。

3.估计预后方面的意义

影响白血病预后的因素是多方面的，包括原始细胞的形态学、细胞遗传学、增殖能力等，但其中某些因素对预后的影响尚未完全清楚。Elgie^［17］通过测定活细胞还原MTT为甲月替的能力测定代谢活力，发现代谢活力较高的原始细胞易获CR，且平均生存期长。因此代谢活力也可以作为估计预后的指标之一。研究还发现代谢活力低的对6-硫代鸟嘌呤(6-TG)显著敏感，而活力高的对Ara C较敏感，因为Ara C的毒性是依赖于经磷酸化后成为活性形式Ara-CTP，而代谢活力低者无足够的能量使之磷酸化。根据代谢活力选择适当的药物可能会改善预后。或者通过刺激原始细胞的代谢活性，而增强对特定的细胞毒药物的反应。Pieters^［18］首次以随访的方式研究了MTT药敏与ALL长期临床反应的关系，发现体外对PDN敏感性与预后关系很大。高危组显示PDN耐药，2/3复发ALL均明显对PDN耐药，细胞对PDN耐药在儿童ALL化疗失败因素中是一个重要方面。这与Maung^［14］认为强的松体外耐药可作为一个ALL预后差的标志是相符的。Kaspers^［19］也指出儿童ALL往往比ANLL预后好是由于ALL对PDN、DX敏感性远远大于ANLL(＞15倍)。有一项前瞻性研究正在进行中，用一种方案治疗ALL，研究MTT法与长期临床反应的关系，需要许多年。Pieters^［20］将儿童B-ALL分成四种免疫表型及三个年龄组，研究了与预后的判断价值，cALL与前BALL预后最好，BALL预后最差，而原BALL(proBALL)、T-ALL居中。＜18月和＞10岁是预后差的因素之一，18月～10岁则预后较好。

4.目前存在的问题

MTT法有众多优点，同时也存在潜在的局限性。主要表现在标本混有正常细胞时会影响结果^{［9，10，21］}。一般的研究者认为控制标本中肿瘤细胞比例＞80%较为适宜。若＜80%则用DISC法更适合^［21］。Carmichael^［9］认为MTT法不能区分细胞抑制(cytostatic)和杀细胞(cytocidal)这两种效应。除此之外，MTT方法学上尚没有一个国际统一的技术顺序，各研究机构采用的药物浓度、药物与细胞作用时间的选择及敏感标准的设立各不相同，不利于资料积累和比较。因此，尚需从回顾性研究进一步明确MTT试验对急性白血病人临床用药的指导价值，能否超越经验方案直接指导临床用药、能否用来参与制定复发难治病例