关键词： 重组腺病毒载体；反义c-myc；安全性；基因治疗

【摘要】目的研究携带反义c-myc的重组腺病毒(Ad-ASmyc)潜在的副作用，评价其安全性，为其进一步进入临床试验提供依据。方法用Ad-ASmyc感染HeLa细胞，制备细胞提取液后反复两次感染HeLa细胞，观察Ad-ASmyc的繁殖、扩增，以及对HeLa细胞的作用，RT-PCR检测其DNA的转录；确定Ad-ASmyc对作为正常细胞的人胚肺二倍体细胞2BS的感染能力，绘制细胞生长曲线，观察Ad-ASmyc对正常细胞的毒性；给Balb/c小鼠腹腔注射重组腺病毒后，每日观察一般状况，化验肝、肾功能，PCR检测Ad-ASmyc在重要脏器中的分布，显微镜观察重要脏器的病理学变化。结果Ad-ASmyc是一复制缺陷型腺病毒，它能高效感染2BS细胞，但并不影响其生长，小鼠体内应用后，无急性毒性症状发生，在肝、肾、胃、脾内可检测到腺病毒的分布。但在注射10⁹ pfu第6天、第12天的小鼠肝组织内可观察到轻微炎症。结论Ad-ASmyc应用是安全的，可以进入临床试验。

Safety evaluation of Ad-ASmyc in vitro and in vivo

ZHANG Haizeng, LIN Chen, WEI Yue, et al.

（ Department of Abdominal Surgery, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）

【Abstract】ObjectiveTo assess the safety of adenovirus-mediated transfer of anti-sense c-myc(Ad-ASmyc).MethodsRT-PCR was used to detect the transcription of Ad-ASmyc in HeLa cells infected with extracts from HeLa cells previously infected with Ad-ASmyc. Cell count was used to observe the effects of Ad-ASmyc on the growth of normal human fetal lung diploid cell line 2BS. Ad-ASmyc was given to 2 groups of Balb/c mice by intraperitoneal injection at a dosage of 10⁷ pfu and 10⁹ pfu respectively. Blood samples were obtained from the mice for liver and renal function tests. PCR was used to screen the vital organs for the presence of adenovirus DNA. Microscopic examination of the vital organs was performed to observe the pathogenicity of Ad-ASmyc.ResultsAs a replication-defective virus, Ad-ASmyc could infect 2BS cells effectively, but did not inhibit 2BS cell growth. No mouse died and no signs of general toxicity following intraperitoneal injection of Ad-ASmyc were observed. In mice injected with 10⁹ pfu Ad-ASmyc, the adenoviral vector was found in the liver, spleen, kidney, and stomach. On day 6 and day 12 after injection, mild inflammatory infiltration of mononuclear cells was observed.ConclusionThe use of adenoviral vector for antisense c-myc gene transfer in vitro and in vivo is considered to be safe for clinical trial.

【Subject words】Recombinant adenovirus vector;Antisense c-myc;Safety;Gene therapy

腺病毒载体是目前基因治疗领域内最为广泛应用的病毒载体之一，且已成为体内基因治疗方案的首选载体。自从1993年美国国立卫生研究院批准第1例腺病毒(adv)介导的基因治疗临床方案，目前世界范围内的肿瘤基因治疗临床方案已有超过10项采用adv 作为载体^［1］。目前应用的adv载体多为E1、E3区缺失的第1代adv载体，为复制缺陷adv，这已为很多实验所证实，但也有人发现，它可能经同源重组等原因而重新获得复制能力。在动物体内接种远高于治疗剂量的重组adv时(＞10⁷ pfu) 并无明显的临床症状，但靶器官内可有剂量依赖性的轻微炎症。安全性是adv载体临床应用的关键问题之一。我室构建的携带反义c-myc重组腺病毒(Ad-ASmyc）已在多种肿瘤细胞体外、体内试验中证实具有明显的治疗效果。为评价其安全性，我们对Ad-ASmyc的复制能力及其对正常细胞、正常组织的作用进行了研究，为其进入临床试验提供依据。

材料与方法

1.细胞系：腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系293（购自加拿大Microbix Biosystems公司），人肝细胞癌细胞系BEL-7402，人胚肺二倍体细胞2BS和人宫颈癌细胞系HeLa均为本室保存。

2.Ad-ASmyc构建、扩增、纯化、滴度测定：采用同源重组法构建表达反义c-myc的重组体腺病毒Ad-ASmyc。用构建好的重组adv感染293细胞，48 h后，细胞出现完全病变时，收集细胞，离心，弃去上清，PBS重悬，冻融3次，再离心，取上清，加入10%甘油，0.25 μm滤器过滤、分装后，于-70℃保存。用有限稀释法进行滴度测定。

3.病毒感染率的测定：用带有LacZ报告基因的Ad-LacZ按不同的感染复数(multiplicity of infection， MOI）感染细胞，24～48 h后固定细胞，X-Gal染液染色，显微镜下观察被染成蓝色的细胞即为LacZ基因表达的阳性细胞，计数蓝染百分率，确定重组adv的感染效率。

4.感染病毒扩增试验^［2］：由于HeLa细胞对adv敏感，故我们采用HeLa细胞来进行此项实验。HeLa细胞接种3×10⁶细胞／100 mm平皿，培养过夜，按MOI=100感染Ad-ASmyc 和Ad-LacZ，分别感染两皿。感染第3天后，进行如下处理：①观察形态。②每组取一皿提取RNA待行RT-PCR。③另一皿用于收集细胞，PBS重悬，-70℃及37℃水浴中3～5次充分冻融，离心去除细胞碎片，收集上清即为第1轮细胞提取液。④用第1轮提取液感染HeLa细胞(5×10⁵/100 mm平皿)。⑤第5天后用上述方法分别提取RNA及制备第2轮细胞提取液。⑥重复上述步骤，提取第2轮提取液，感染第5天后HeLa细胞的RNA。

5.细胞生长曲线：于35 mm培养皿接种一定量的细胞，培养过夜，按一定MOI感染细胞，观察形态。每种处理于每个时间点设3个平行组。定期消化收集细胞，2%台盼蓝染色，显微镜下分别计数活细胞和死细胞，求平均值及标准差，绘制生长曲线。

6.RT-PCR：提取总RNA，定量后进行逆转录，逆转录产物行PCR，tubulin为内对照。c-myc引物(扩增产物250 bp)上游：5′-CTCTCAACGACAGCAGCC-CG-3′；下游：5′-CCAGTCTCAGACCTAGTGGA-3′；tubulin引物(扩增产物410 bp)上游：5′-CTCATCA-CAGGCAAGGAAGAT-3′；下游：5′-TTAAGGTAAGTG-TAGGTTGGG-3′;adv引物(扩增产物860 bp)上游：5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′；下游：5′-CATCT-GAACTCAAAGCGTGG-3′。退火温度52～55℃，扩增c-myc的退火温度为52℃，33个循环；扩增adv的退火温度为54℃，40个循环。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，照相。

7.小鼠体内实验^［2］：Balb/c雄性小鼠6周龄（购自中国医学科学院肿瘤研究所动物室），按体重随机分为3组，每组分别经腹腔注射PBS(对照)、Ad-ASmyc (10⁷ pfu／只)及Ad-ASmyc(10⁹ pfu／只)。每日观察一般状况，包括日常行为、食欲、皮毛色泽、反应灵敏性、活动、腹泻、体重。每组分别于注射后第3，6，12天各处死1只小鼠，取血，行肝、肾功能检查。取心脏、肺、肝脏、脾、肾、胃、肌肉7种重要脏器，行病理组织学观察。取上述脏器，提取DNA，定量后取4 μg用于PCR，来评价adv在机体内各器官的分布状态。adv引物同RT-PCR，复性温度为54℃，40个循环；PCR产物20 μl行1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察，照相。

结果

一、Ad-ASmyc的体外扩增实验

为确定Ad-ASmyc是否有复制能力，我们采用HeLa细胞感染adv后制备细胞提取液，以连续感染的方法进行研究，若adv有复制能力，则病毒在第2轮、第3轮感染后均可繁殖和扩增，经RT-PCR扩增出adv DNA的转录产物。结果表明，经Ad-ASmyc感染的HeLa细胞出现形态学变化，RT-PCR可扩出相应的adv条带，而用细胞提取液感染细胞时却没有出现相似的形态学变化，RT-PCR也未扩出相应的adv条带(图1)。

m：ΦⅩ174；1：阴性对照；2：Ad-LacZ感染HeLa细胞后第3天；3：第1轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；4：第2轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；5：Ad-ASmyc感染HeLa细胞后第3天；6：第1轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天；7：第2轮细胞提取液感染HeLa细胞后第5天

1Ad-ASmyc在HeLa细胞中的扩增实验

二、Ad-ASmyc对正常细胞的感染及毒性

1.重组adv的转导效率：已知重组腺病毒能在癌细胞中高效介导基因转移，为了确定能否在正常细胞中有效转导，我们用不同MOI的Ad-LacZ感染2BS细胞及BEL-7402细胞，结果显示：MOI=100时，95%以上的2BS细胞即能被感染；MOI=200时，BEL-7402细胞90%以上可被感染；在以后的实验中，2BS、BEL-7402细胞的感染强度分别采用MOI=100和200。

2.Ad-ASmyc感染2BS及BEL-7402细胞后的形态学观察：感染Ad-ASmyc后，2BS与对照组相比无明显变化，而BEL-7402细胞则发生了明显的形态变化：细胞变圆、皱缩，甚至凋亡(图2)。