关键词： 纤粘连蛋白；基质金属蛋白酶；转录调节；卵巢癌细胞

【摘要】目的研究细胞外基质蛋白对肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）基因表达的影响及机理。方法以纤粘连蛋白处理SKOV3卵巢癌细胞后，用明胶-酶谱法和反转录PCR观察MMP分泌及基因表达。以MMP-2启动子转染细胞，通过测定萤火虫酶活性，观察纤粘连蛋白对MMP-2启动子活性的影响。细胞p53含量采用Western blot分析。结果5 μg/mL纤粘连蛋白刺激MMP-2分泌，但不影响MMP-9分泌，这一作用随纤粘连蛋白浓度增加而增强。经10 μg/mL 纤粘连蛋白刺激1 h后，细胞内MMP-2 mRNA量显著增加；作用时间延长，诱导作用减弱。纤粘连蛋白可诱导转染细胞中萤火虫酶活性增加，AP-1功能抑制剂姜黄素（50 μmol/L）不能阻断这一作用。经纤粘连蛋白处理后，细胞内p53含量明显增加。结论纤粘连蛋白可刺激卵巢癌细胞中MMP-2分泌，诱导MMP-2启动子活性增强及mRNA含量增加，这一作用可能与p53蛋白转录因子活性有关，而与AP-1通路无关。

Fibronectin induces matrix metalloproteinase-2 expression in ovarian cancer cells

YAN Chunhong, LI Chunhai, TIAN Fang, et al.

（Department of Tumor Molecular Biology, Research Clinic, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of extracelluar matrix proteins on matrix metalloproteinases (MMPs) expression by cancer cells, and the underlying mechanisms.MethodsFollowing stimulation of SKOV3 ovarian cancer cells by fibronectin, MMPs secretion and cellular mRNA contents were assayed by gelatin-zymography and RT-PCR, respectively. The activity of MMP-2 promoter was monitored by cellular luciferase activity after the cells were transfected with MMP-2 promoter-luciferase construct. Cellular p53 contents were determined by Western blot analysis.ResultsFibronectin (5 μg/ml) was found to stimulate the secretion of MMP-2 but not MMP-9 by SKOV3 cells. The stimulation was enhanced with the increase in fibronectin concentration. When SKOV3 cells were treated with 10 μg/ml fibronectin for 1hr, the cellular MMP-2 mRNA dramatically increased. However, with increase in stimulation time, MMP-2 mRNA content decreased. Fibronectin induced an increase in luciferase activity in cells transfected with MMP-2 promoter construct, whilst curcumin (50 μmol/L), a potent transcription factor AP-1 inhibitor, could not block the fibronectin-induced increase in MMP-2 promoter activity. Fibronectin also induced an increase in p53 content of SKOV3 cells.ConclusionFibronectin stimulates ovarian cancer cells to secret MMP-2 via its enhancing effect on MMP-2 promoter activity with resultant increase in MMP-2 transcription. The effect might involve a pathway associated with p53 but independent of AP-1.

【Subject words】Ovarian neoplasms;Matrix metalloproteinase;Fibromectin;Gene expression

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一类Zn²⁺依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。MMP-2（明胶酶A/72 kDa Ⅳ型胶原酶）和MMP-9（明胶酶B/92 kDa Ⅳ型胶原酶）是两种重要的MMP蛋白，其表达和活性与肿瘤转移密切相关。已经发现IL-1、TNF-α、EGF等可影响MMP-2和MMP-9的表达和活性^［1］，但这些因子在肿瘤转移中的作用并不明确。由于细胞外基质（ECM）是细胞微环境的重要组成成分，在侵袭和转移过程中ECM与肿瘤细胞发生广泛的相互作用，这一相互作用可提供肿瘤转移发生的起始信号^［2,3］，因而也可影响MMP的表达和活性。为研究ECM蛋白对MMP基因表达的可能影响，我们观察了SKOV3卵巢癌细胞经纤粘连蛋白刺激前后MMP基因表达的变化，并对其机理进行了探讨。

材料与方法

1.细胞培养：SKOV3卵巢癌细胞（由解放军总医院程国钧医师惠赠）常规培养于RPMI 1640培养基（含10%小牛血清）中。实验时，在培养基中加入纤粘连蛋白（购自北京医科大学细胞学系）处理细胞。

2.明胶-酶谱法：细胞培养在不含小牛血清的培养基中。24 h后，收集培养上清液。制备含1 mg/ml明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，细胞培养上清液加样电泳。电泳毕，凝胶以2.5% Triton X-100溶液漂洗1 h，在pH 7.5缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl₂）中37℃温育过夜。0.2%考马氏亮蓝染色并脱色后，观察明胶水解负染带^［4］。

3.反转录PCR：细胞以纤粘连蛋白处理后，用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。2 μg总RNA用AMV逆转录酶进行反转录，PCR扩增MMP-2和MMP-9 cDNA，并同时扩增β-actin作为内参照。扩增MMP-2的引物顺序为：5′-ACCTGGATGCCGTCGTG-GAC-3′和5′-TGTGGCAGCACCAGGGCAGC，扩增片段长度为447 bp；MMP-9的引物顺序为：5′-GAGGTTC-GACGTGAAGGCGCAGATG-3′和 5′-CATAGGTCACGT-AGCCCACTTGGTC-3′，扩增片段长度为200 bp；β-actin引物顺序为：5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′和 5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，扩增片段长度为621 bp 。PCR条件经优化，反应体系中含2.5 μmol/L MgCl₂、0.5 μmol/L MMP-2或MMP-9引物、0.1 μmol/L β-actin引物；94℃变性5 min后，加入Taq 酶，94℃变性1 min，68℃复性30 s，72℃延伸50 s，32个循环后，72℃延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色。

4.细胞转染及萤火虫酶活性测定：克隆有MMP-2启动子的萤火虫酶报告质粒pGL-Promoter^［5］由Sun Yi博士（美国Warner-Lambert公司）惠赠。约4×10⁵细胞接种至直径60 mm平皿，培养过夜，加入6 μg pGL-Promoter质粒与40 μl lipofectin (Gibico公司)混悬液，转染细胞6 h。2 d后，细胞转接种至直径33 mm平皿中，培养过夜。转染细胞用10 μg/ml纤粘连蛋白刺激1 h后，用1×CCLR（Promega公司）裂解，离心收集上清液，取5 μl上清液用BCA法^［2］测定蛋白浓度，另取20 μl加入至100 μl萤火虫酶活性分析液（Promega公司）中，用液闪仪测定其每分钟闪烁次数(c/min)^［6］。样品中MMP-2启动子活性可通过下述公式计算：启动子活性=c/min^1/2/样品蛋白量，即每μg蛋白所含萤火虫酶活性，以相对活性表示。

5.Western blot分析：细胞以含50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、150 mmol/L NaCl、0.1%SDS、0.5%去氧胆酸钠、1%NP-40和蛋白酶抑制剂（Sigma公司）的缓冲液裂解细胞。细胞裂解上清液用BCA法^［2］测定蛋白浓度。30 μg蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素滤膜上。滤膜经1%BSA封阻1 h，加入1∶1 000稀释的鼠抗p53单抗（Santa Cruz公司）4℃过夜，用辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗检测杂交蛋白。

结果

1.纤粘连蛋白对MMP蛋白分泌的影响：HT1080人纤维肉瘤细胞分泌MMP-2和MMP-9，在明胶-酶谱上形成2条主要的明胶水解负染条带(图1)，常作为MMP-2和MMP-9参照。在正常培养条件下，SKOV3细胞不分泌MMP蛋白；将纤粘连蛋白加入到培养液中，SKOV3细胞被刺激产生并分泌MMP-2蛋白。纤粘连蛋白刺激MMP-2分泌作用的强弱与其浓度密切相关，5 μg/ml纤粘连蛋白即可刺激MMP-2分泌，这一作用随纤粘连蛋白浓度升高而增强（图1）。纤粘连蛋白不刺激SKOV3分泌MMP-9蛋白。

1：对照SKOV3细胞；2～5：SKOV3细胞分别经1，5，10，20 μg/ml纤粘连蛋白处理；6：HT1080细胞参照

1细胞无血清培养上清液的明胶-酶谱

2.纤粘连蛋白对MMP-2 mRNA含量及启动子活性的影响：用10 μg/ml纤粘连蛋白刺激SKOV3细胞1，2，4，8和24 h后，提取细胞总RNA，反转录后用PCR扩增MMP-2及MMP-9 mRNA。结果显示，未经刺激的SKOV3细胞内几乎检测不到MMP-2 mRNA；细胞经纤粘连蛋白刺激1 h后，细胞内MMP-2 mRNA量明显增加（图2a）。但当作用时间延长时，纤粘连蛋白对MMP-2表达的刺激作用反而减弱。将带有MMP-2启动子区的报告基因载体pGL-Promoter转染SKOV3细胞，转染细胞经10 μg/ml纤粘连蛋白刺激1 h后，萤火虫酶活性明显增强（图3），表明纤粘连蛋白可诱导MMP-2启动子活性增强。与明胶-酶谱法的结果一致，纤粘连蛋白不诱导细胞内MMP-9 mRNA量增加（图2b）。

1：质粒阳性对照；2：对照SKOV3细胞；3～7：SKOV3细胞经10 μg/ml纤粘连蛋白分别处理1，2，4，8，24 h；8：阴性对照

2反转录PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳图