新近发现的PTEN(又名MMAC1/TEP1)基因位于染色体10q23.3，含9个外显子，是第一个呈双专一性磷酸酶(DSP)活性的抑癌基因^［1］。PTEN表达产物参与细胞骨架重组及由此引发信号转导并影响细胞转移。现已发现多种肿瘤如恶性胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌中PTEN频繁突变^［1，2］。肿瘤中PTEN基因突变导致其磷酸酶活性剧降，细胞恶性增殖能力增强。此外，PTEN突变失活，从而致使细胞游走性增加并抑制细胞凋亡^［2，3］。但肝细胞癌中PTEN基因的突变研究，国内外未见报道。因此，我们以Southern杂交检查PTEN的缺失，以PCR-SSCP分析PTEN基因突变高发的外显子5和外显子8，以探索人肝细胞癌PTEN突变的特点。

一、材料和方法

1.标本：经病理证实的34例人肝细胞癌组织及癌周正常组织。

2.Southern杂交：10 μg基因组DNA以EcoRⅠ酶切，80 V电泳7 h。凝胶碱变性转移到尼龙膜，以α-³²P-dCTP标记的PTEN cDNA探针杂交，放射自显影。

3.PCR-SSCP分析：PCR引物及扩增条件：第5外显子：5′ ACC TGT TAA GTT TGT ATG CAA C 3′(sense)，5′ TCC AGG AAG AGG AAA GGA AA3′(antisense)；第8外显子：5′CTC AGA TTG CCT TAT AAT AGT C3′(sense)，5′ TCA TGT TAC TGC TAC GTA AAC 3′(antisense)。50 μl反应体系含模板DNA 100 ng，引物各20 pmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，Perkin-Elmer PCR仪中进行。SSCP分析：PCR产物5 μl，其中第8外显子产物以Taq Ⅰ酶切。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，8 mA稳流电泳18 h，银染观察单链条带位置变化。

二、结果

1.人肝细胞癌PTEN缺失分析：Southern杂交结果显示，肝癌组织和癌周组织均具有7条杂交带，肝癌组织未发生异常条带。提示肝癌组织未发生PTEN纯合性缺失、半合性缺失或大片段缺失。

2.人肝细胞癌PTEN第5、第8外显子突变分析：在34例人肝细胞癌中，有2例肝细胞癌PTEN第5外显子均显示有1条额外电泳迁移带，异常迁移带位置相同，提示第5外显子突变位点可能相同，突变率为5.9%(2/34)。第8外显子有1例肝癌组织SSCP表现为6条额外带，突变率为2.9%(1/34)。第5、第8外显子合计突变率为8.8%(3/34)。

三、讨论

抑癌基因二次突变学说认为，染色体严重改变可使抑癌基因一个等位基因缺失，而另一个等位基因突变导致抑癌基因失活。抑癌基因PTEN位于10q23.3，而肝细胞癌10q杂合性缺失频率高达33%左右，因此研究PTEN基因的突变和失活可望进一步了解肝细胞癌的发生发展机理。

对多种肿瘤PTEN基因的突变研究显示，在不同肿瘤及同种肿瘤不同分化型中PTEN突变率、突变方式可不同。恶性胶质瘤PTEN缺失和突变发生率达17%，在乳腺癌细胞株和移植物突变率仅6%。前列腺癌中既有纯合性缺失，也发生半合性缺失。乳腺癌胶质瘤中PTEN发生纯合性缺失，胶质瘤中点突变造成翻译错义、无义、移码，而且点突变多发生于第5外显子(4/11)和第8外显子(3/11)。我们运用Southern杂交，未发现肝细胞癌中PTEN片段缺失。鉴于Southern杂交主要用于确定缺失与否而无法检测DNA序列的微小突变，因此我们继之采用PCR-SSCP技术检测人肝细胞癌PTEN基因微小突变。SSCP突变检测方法对＜300 bp的片段的灵敏度较高，因此我们以限制性内切酶Taq Ⅰ将长约550 bp的第8外显子PCR产物切为270 bp和280 bp两个片段。在SSCP图谱上，一个片段表现为两条单链和一条双链，共三条迁移带，两个片段则显示6条迁移带。肝癌细胞呈克隆异质性，因此在SSCP图谱上，突变条带表现为额外带。结果显示第5、第8外显子突变率为8.8%。尽管PTEN结构基因突变频率不太频繁，但其顺式调控元件是否突变并影响表达仍待研究。深入研究PTEN基因结构与功能的关系及与癌基因、其它抑癌基因的相互作用，无疑有助于探讨肝细胞癌和其它恶性肿瘤的发病机理，并为未来可能的基因治疗提供新的依据。

基金项目：国家教委博士点基金、卫生部基金和上海市教委重点学科项目基金资助项目

参考文献：

［1］Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, et al. Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers. Nat Genet, 1997,15：356-362.

［2］Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatese gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science, 1997,275：1943-1947.

［3］Maehama T, Dixon JE. The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate. J Biol Chem, 1998,273：13375-13378.

收稿日期：1999-04-05