关键词： p27kip1基因；腺病毒；细胞周期；基因转移；蛋白表达

【摘要】目的研究外源性p27kip1基因对细胞周期及细胞增殖的影响。方法构建CMV启动子转录调控的含人p27kip1 cDNA的E1区替代的腺病毒载体pAxlcw .CIhp27kip1，与经 EcoT221酶切的Ad5腺病毒DNA－末端肽复合物共转染293细胞，制备p27kip1 重组腺病毒，在体外转染HeLa细胞，Western blot、FACS及MTT检测分析外源性p27kip1蛋白在细胞内的表达，以及对细胞周期及细胞增殖的影响。结果获得含人p27kip1 cDNA的重组腺病毒，滴度为1.7×10⁹ pfu/ml。体外转染HeLa细胞24 h后，p27kip1蛋白在p27kip1转染后的HeLa细胞中高表达；FACS检测表明，p27kip1和LacZ重组腺病毒转染后的HeLa细胞，经10%血清刺激后处于G₁期的细胞分别为89.93%和59.84%；MTT法检测表明，人p27kip1重组腺病毒转染后的HeLa细胞经20％血清刺激后，48及72 h的A值均低于LacZ重组腺病毒转染后的HeLa细胞(P＜0.01)。结论本研究中所制备的p27kip1重组腺病毒能有效介导外源性p27kip1 基因在体外转染HeLa细胞并高表达p27kip1，抑制细胞由G₁期向S期过渡，从而抑制细胞增殖，为进一步研究p27kip1 基因治疗奠定了基础。

Construction of adenovirus vector for human p27kipl gene and its expression

PAN Xiaoming, ZHANG Weiping, WU Zonggui, et al.

（ Department of Cardiology, Changzheng Hospital and Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of exogenous p27kip1 gene on cell cycle and proliferation.MethodsE1 substitutive adenovirus vector pAxlcw containing human p27kip1 cDNA (Cihp27kip1) under the transcriptional control of CMV promoter was constructed and then cotransfected with Ad5 adenovirus DNA-terminal peptide complex EcoT221-digested into 293 cells for preparing p27kip1 recombinant adenovirus Adhp27kip1. After infecting HeLa cells for 24 h, the exogenous p27kip1 protein expression in HeLa cells and its effects on cell cycle and proliferation were determined by Western blot, FACS and MTT assay.ResultsThe titers of resultant recombinant adenoviruses was 1.7×10⁹ pfu/ml. p27kipl protein was over-expressed in HeLa cells infected with p27kipl recombinant adenovirus for 24 h, resulting in blockage of cell cycle transition from G₁ phase to S phase and inhibition of cell proliferation.Conclusionp27kipl recombinant adenoviruses prepared in this study can efficiently transfer p27kipl gene into HeLa cells and over-express p27kipl protein in the infected cells. Adhp27kipl can be used as an agent for gene therapy.

【Subject words】p27kipl gene; Adenovirus;Cellcycle;Gene transduction;Protein expression

细胞周期作为细胞增殖与分化的最后共同通路，在调控细胞增殖与分化的过程中发挥着重要作用。周期素依赖激酶抑制物（CKIs）是近年来日益受到重视的一类细胞周期负性调节物，这类抑制物在细胞内的表达显著影响了细胞周期各期间的顺序过渡，从而导致细胞生物学行为的改变。p27kip1抑制细胞增殖^［1］，同时，在促进细胞分化成熟、促进细胞凋亡的过程中也起着重要作用^［2，3］。作为基因转移的载体，与逆转录病毒比较，腺病毒具有能转染多种处于静止期的细胞，基因携带量大，易于体外扩增，安全性高等优点^［4］。因此，我们构建了含人p27kip1 cDNA的重组腺病毒载体，在体外观察其对HeLa细胞的p27kip1基因转染及表达，为进一步研究p27kip1的生物学作用以及肿瘤和其他以细胞增殖、分化异常为病理学基础的疾病的基因治疗奠定基础。

材料与方法

1.主要试剂：人全长p27kip1 cDNA由Memorial Sloan Kettering Cancer Center Massague博士惠赠；真核表达载体pCIcc、E1区替代的腺病毒载体pAxlcw由日本东京大学Saito博士惠赠；LacZ重组腺病毒(AdLacZ，滴度3×10⁹pfu/ml)由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠。兔抗人p27kip1多抗、辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG单抗及荧光自显影试剂购自Santa Cruz。

2.细胞株及细胞培养：HeLa细胞、人胚肾细胞株293细胞由本室保存，用改良DMEM培养基加10％小牛血清，5％ CO₂、37℃培养。

3.人p27kip1重组腺病毒载体的构建：从pCMV5-kip1载体中切出含人p27kip1 cDNA的kpnⅠ、BamHⅠ小片段（约690 bp），编码区长约610 bp。BamH Ⅰ酶切后，用T₄聚合酶补平BamH切口，再用kpn酶切，将此片段克隆至真核表达载体pCIcc的kpnⅠ、SmaⅠ位点，使其受CMV启动子的转录调控，所得到的重组子pCI-p27含有CMV-hp27kip1-SV40 polyA完整的表达单元。将含此表达单元的ClaⅠ小片段（2 062 bp）与pAxlcw 的ClaⅠ大片段连接，连接反应液经噬菌体蛋白体外包装后感染细菌DH5α，选择左向转录的阳性克隆pAxlcw-CIhp27，大量制备其DNA，经CsCl超速离心纯化后与经E-coT221酶切的Ad5腺病毒DNA-末端肽复合物共转染293细胞，制备人p27kip1重组腺病毒（Adhp27kip1）。重组腺病毒的扩增、鉴定及滴度测定参见文献［5］。

4.p27kip1蛋白的Western blot 检测

取5×10⁵ HeLa细胞培养于6 cm平皿中，待细胞铺至约60%时，用HBSS洗2遍，加入500 μl含LacZ(AdLacZ)或hp27kip1重组腺病毒(Adhp27kip1)（MOI 40）的无血清DMEM，置37℃培养1 h，每隔15 min，轻轻摇晃平皿；转染后的细胞用HBSS洗1遍后，加入含10%的小牛血清的DMEM，置37℃ 5%CO₂中继续培养24 h；用PBS洗一遍，加入500 μl 预冷的RIPA液（1×PBS，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，5 μl 10 mg/ml苯磺酰氟，15 μl抑肽酶，5 μl 100 mmol/L正矾酸钠）后刮下细胞，冰浴30 min，超声剪切DNA，16 000×g，4℃离心20 min，取上清，测蛋白浓度；以30 μg上样，经12% SDS聚丙酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用Blotto A(1×TBS，5%脱脂奶粉，0.05%吐温-20)封闭40 min后，与兔抗人p27kip1多克隆抗体结合1 h，再与辣根过氧化物酶结合的二抗结合30 min，用萤光自显影试剂处理后，于X线感光胶片上显影。

5.HeLa细胞Adhp27kip1转染后的细胞周期分析：取1.7×10⁵ HeLa细胞培养于六孔板中，待细胞铺至约60%时，用HBSS洗2遍，加入含0.5%小牛血清的DMEM，37℃5%CO₂中培养24 h后，如上述方法转染人p27kip1重组腺病毒或LacZ重组腺病毒；加入含1%小牛血清的DMEM，37℃ 5% CO₂中继续培养24 h后，弃去原培养液，加入含20%小牛血清的DMEM，置37℃ 5% CO₂中培养48 h，用0.1%胰蛋白酶消化后搜集细胞，于枸橼酸钠溶液中4℃固定过夜；PI染色，室温，30 min，FACS（FACScalibur Becton-Dickinson公司）检测进行细胞周期分析。

6.Adhp27kip1体外转染对HeLa细胞增殖的影响：以上述方法在96孔板中转染人p27kip1重组腺病毒（MOI 40）或LacZ重组腺病毒（MOI 40），于0，24，48，72 h，以MTT法检测细胞增殖。每个时间点样本设3复孔，检测前待测标本中每孔加入MTT10 μl，继续培养16 h后，3 000 r/min离心3 min，弃去培养液，加入DMSO 100 μl/孔，37℃孵育5 min后，用Bio-RAD 550型酶联仪于570 nm测A值(吸光度，曾称光密度OD)。全部重复检测3次，取平均值。

7.统计学处理：所得数据以±s表示，作配对t检验，P＜0.05为差异有显著性。

结果

1.人p27kip1重组腺病毒载体的构建：首先将人p27kip1 cDNA克隆至pCIcc载体中，使其受CMV启动子转录调控，后接SV40 polyA，再将此表达单元CMV-hp27kip1-SV40 polyA克隆至腺病毒载体pAxlcw，得到的重组体pAxlcw-Cihp27，酶切鉴定正确后（图1），经COS/TPC共转染293细胞，同源重组产生人p27kip1的重组腺病毒，经酶切鉴定正确后（图2），扩增到的重组腺病毒（3^rd seed）滴度为1.7×10⁹ pfu/ml。

2.人p27kip1重组腺病毒介导的p27kip1蛋白体外表达：Western blot表明，Adhp27kip1(MOI 40)转染HeLa细胞后，p27kip1蛋白在转染后的HeLa细胞中高表达，而AdLacZ转染的HeLa细胞中，则仅能检测出极低水平的p27kip1蛋白(内源性)的表达。说明本实验所构建的人p27kip1重组腺病毒可正确地表达人p27kip1的基因，并在HeLa细胞内实现其蛋白产物的高表达（图3）。

3.Adhp27kip1体外转染对HeLa细胞细胞周期的影响：人p27kip1重组腺病毒（MOI 40）转染的HeLa细胞经10%血清刺激后，FACS检测显示89.9%的细胞处于G₁期，而LacZ重组腺病毒转染的HeLa细胞经10%血清刺激后，仅有59.8%的细胞处于G₁期，表明外源性p27kip1蛋白在HeLa细胞高表达可在G₁期抑制细胞周期向S期过渡。