关键词： 肝肿瘤；癌，肝细胞；热休克蛋白70

【摘要】目的建立热休克蛋白70 (hsp70)的分离方法，观察其在小鼠体内的特异抗瘤效应。方法用经43℃热处理12 h的H22细胞，制备裂解液，用DEAE52、ConA和ADP柱进行序贯分离，所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定。用纯化的hsp70蛋白免疫A组C3H 及C组C57BL/6小鼠, RPMI 1640 液免疫B组C3H 及D组C57BL/6小鼠。 第15天A、B组小鼠用H22攻击，C、D组小鼠用EL-4攻击，观察各组小鼠肿瘤发生率及肿瘤大小。结果纯化蛋白经鉴定确系相对分子质量约为70 000的hsp70蛋白。A组小鼠肿瘤发生率为0/6，而B组小鼠肿瘤发生率为6/6。C组和D组小鼠的肿瘤发生率均为6/6，两组小鼠第35天的肿瘤大小差异无显著性。结论用上述蛋白层析法可分离获得纯度高、并保留肿瘤抗原信息的hsp70蛋白。该蛋白免疫后的小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击，而对异种肿瘤细胞的抵抗能力有限。 提示纯化蛋白中的抗原信息可能不是hsp70蛋白本身，而是其所携带的小分子多肽。

Purification of hsp70 and its immunoprotective effect against mouse hepatoma

WU Weizhong, LIU Kangda, GAO Yanqin, et al.

（Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China）

【Abstract】ObjectiveTo purify hsp70 protein and observe its anti-tumor effect on mouse H22 hepatoma.MethodsCytosolic hsp70 protein of heat treated H22 cells was purified successively by chromatographic procedures, including DEAE 52-cellulose, ConA-sepharose 4B and ADP-argarose chromatography. The molecular weight and the identity of the purified hsp70 protein were confirmed by SDS-PAGE and Western blot. Tumorigenicity of H22 hepatoma was examined in purified hsp70-treated C3H mice.ResultsA sharp stained protein band with a molecular weight of about 70 kD was obtained and shown to be hsp70 as confirmed by Western blot. In C3H mice challenged with H22 hepatoma, tumor developed in 6 of 6 mice while in hsp70 pretreated mice, none of the 6 H22 challenged mice developed tumor. Nevertheless, C57BL/6 mice pretreated with hsp70 or RPMI 1640 all developed tumor upon challenge with EL-4 lymphoma.ConclusionThe results suggest that the immunoprotective effect of hsp70 protein is due not to hsp70 per se, but rather to the specific antigenic peptides it carries.

【Subject words】Liver neoplasms;Carcinoma, hepatocellular;Heat shock protein70

hsp70蛋白的抗肿瘤作用已日益受到重视，但对其抗肿瘤机理及所携带多肽性质知之甚少。国外有学者试图从肿瘤细胞中直接纯化hsp70蛋白，以明确其所携带多肽的氨基酸结构与肿瘤特异性抗原间的关系。其中Peng等^［1］用ADP亲和层析法成功地从小鼠纤维肉瘤meth A细胞中分离获得hsp70蛋白，并证实该纯化蛋白具有肿瘤免疫原性。我们从以往的研究中发现，以热休克、丝裂霉素、β-榄香烯等因素处理H22细胞，均能使后者高表达hsp70蛋白^［2，3］，且在体内外可诱导出肿瘤杀伤性γδT细胞，激发机体产生抗同种肿瘤细胞的特异性免疫^［4，5］。为证实这些抗瘤效应是由hsp70蛋白而不是其他分子所介导的，并进而分析小鼠肝癌H22细胞来源的hsp70蛋白所携带肝癌特异抗原的结构，我们用改良的蛋白层析法，分离提纯热休克后H22细胞的hsp70蛋白，并以纯化蛋白免疫C3H、C57BL/6小鼠观察其抗肿瘤效应。

材料与方法

1.实验材料：DEAE 52-cellulose(Whatman)；CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)；Con A、ADP-Agarose及2′ 5′-ADP(Sigma)；抗鼠 hsp70 单抗 (Santa Cruz)；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体(中国科学院上海生物化学研究所)；DAB(Sigma)；硝酸纤维素薄膜(Amersham, Life Science)；蛋白分子量Marker(Promega)。

2.层析缓冲液：(1) 细胞裂解液(Buffer A)： 20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5内含20 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L DTT及0.5 mmol/L PMSF。(2) DEAE-52柱平衡液及洗脱液(Buffer B)：20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.6。平衡液内含20 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L EDTA，15 mmol/L 2-巯基乙醇(2-ME)；洗脱液内含500 mmol/L NaCl，余组份同平衡液。(3)Con A柱洗脱液(Buffer C)：50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，内含0.15 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L CaCl₂，15 mmol/L巯基乙醇(2-ME)。(4) ADP柱平衡液及洗脱液(Buffer D)：平衡液为20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，内含20 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl₂ ，15 mmol/L 2-ME。洗脱液内含500 mmol/L NaCl，余组份同平衡液。

3.实验动物：4周龄C3H、C57BL/6小鼠，雌雄各半，均购自中国科学院上海实验动物中心。

4.Hsp70蛋白制备：腹水来源H22细胞，共30 ml压积，经43℃休克12 h后，用10倍体积Buffer A及超声破膜，100 000 g超速离心30 min，取上清，4℃Buffer B透析过夜。

5.Hsp70蛋白纯化：(1)DEAE-52柱分离^［6］：上述样品10 ml加至直径1.2 cm、长20 cm的DEAE-52柱上，用Buffer B平衡液及洗脱液进行梯度洗脱，条件为每管4.8 ml/12 min，共15 h。测吸光度(曾称光密度OD)A_λ=280 nm值，收集各峰蛋白，经浓缩、透析后置4℃保存。(2)Con A柱分离^［7］：制备1根10 ml的Con A-Sepharose 4B柱（方法参见公司说明书），将DEAE-52柱分离第一峰蛋白上样至Con A柱上，用Buffer C洗脱6 h，条件为每管4.8 ml/9 min，测A值，收集蛋白，浓缩后用Buffer D透析过夜。(3) ADP柱分离^［1］：上述样品加至5 ml ADP柱上，用Buffer D平衡液先洗脱2 h，然后改用洗脱液洗脱3 h，检测A值，收集蛋白，浓缩透析后4℃保存。

6.蛋白分子量及性质鉴定^［8］：不同柱分离样品用5%和7.6%双层不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白分子量及纯度鉴定。ADP过柱样品电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜上。经常规漂洗、封闭后，用鼠抗鼠hsp70单抗(1∶200)为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体作为二抗，DAB进行显色，观察结果。具体方法参见《分子克隆实验指南》有关章节。

7.体内免疫试验：将12只C3H和12只C57BL/6小鼠均分成4组。其中A组6只C3H小鼠和C组6只C57BL/6小鼠分别用纯化的hsp70蛋白进行皮下免疫，每鼠为30 μg/100 μl，共2次，中间隔7 d。B组6只C3H小鼠和D组6只C57BL/6小鼠分别用RPMI 1640液免疫作阴性对照，途径及剂量同前。第15天时，A、B组小鼠用5×10⁴的H22细胞进行皮下攻击，而C、D组小鼠用3×10⁴的EL-4细胞（小鼠淋巴瘤细胞）进行皮下攻击。自攻击日至第35天，每隔3天观察并记录小鼠肿瘤大小及肿瘤发生率。

结果

1.DEAE-52柱层析结果：H22细胞裂解液经DEAE-52柱梯度洗脱分离后，共有4个蛋白洗脱峰（图1）。第1峰蛋白经电泳鉴定发现有多条蛋白带，在相对分子质量66 200～97 400间有3条蛋白带，其中一条分子量约为70 000左右，另两条为≥90 000的蛋白带，≤43 000处约有7条蛋白带。

图1DEAE 52-cellulose柱层析梯度蛋白洗脱图

2.Con A柱层析结果：DEAE-52柱洗脱第1峰样品经Con A进一步层析分离后，可分为Con A结合及不结合两部分。其中Con A不结合蛋白经电泳鉴定，发现含目的蛋白且纯度增高。在相对分子质量70 000处有一淡染的蛋白带，而在分子量43 000处有一深染的蛋白带。

3.ADP柱层析结果：上述样品进一步用ADP柱进行亲和层析分离，Buffer D洗脱液中的蛋白经电泳鉴定，发现仅在相对分子质量70 000处有一染色清楚的蛋白带。至此我们得到了较纯的、分子量约为70 000的蛋白。

4.蛋白性质鉴定：将上述纯化所得的蛋白用特异性Western blot法鉴定，证实该蛋白确系hsp70蛋白。上述分离及鉴定结果见图2。

1：Markers；2：DEAE 52柱第1峰样品；3：Con A柱样品(不结合部分)；4：ADP柱样品(结合部分)；5：ADP柱样品(结合部分)免疫印迹结果

2不同层析柱分离蛋白SDS-phage电泳及Western blot鉴定结果

5.C3H小鼠肿瘤生长情况：B组小鼠在H22肝癌细胞攻击后第9天陆续出现肿瘤生长，至攻击后第35天，肿瘤的发生率为6/6，而A组小鼠同期内肿瘤的发生率为0/6。

6.C57BL/6小鼠肿瘤生长情况：C组小鼠在EL-4淋巴瘤细胞攻击后第35天，肿瘤发生率为6/ 6，最早触到肿瘤时间为攻击后第16天。 而D组小鼠第13天陆续出现肿瘤生长，同期肿瘤的发生率为