关键词： 羟基喜树碱；放射治疗；放射增敏

【摘要】目的应用克隆形成方法，研究羟基喜树碱(HCPT)对人鼻咽癌细胞系(CNE)和胃癌细胞系(BGC-823)的放射增敏作用。方法实验分为单纯照射组和照射加药组。照射加药组在照射后均立即给予HCPT 2 μg/ml(药物剂量为ID₅₀剂量)，37℃孵箱内作用4 h。应用克隆形成方法，观察单纯照射和照射加HCPT对细胞的杀伤作用。计算细胞存活率，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图。结果BGC-823细胞单纯照射组D₀值为1.17 Gy，D_q值为1.91 Gy，N值为5.14；照射加HCPT组D₀值为0.95 Gy，D_q值为0.01 Gy，N值为1.01；放射增敏比(SER)为1.23(1.17/0.95)。CNE-Ⅰ细胞单纯照射组D₀值为1.60 Gy，D_q值为0.65 Gy，N值为1.5；照射加HCPT组D₀值为0.95 Gy，D_q值为0.01 Gy，N值为1.01；SER为1.68(1.6/0.95)。结论研究结果显示，HCPT具有一定的放射增敏作用，为临床的放疗和HCPT的联合应用提供了实验依据。

In vitro study of radiation sensitizing effect of hydroxycamptothecin

WANG Lühua, YANG Weizhi,

（Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the radiation sensitizing effect of hydroxycamptothecin (HCPT) on human stomach adenocacinoma and nasopharyngeal carcinoma.MethodsHuman stomach cancer cell line BGC823 and nasopharyngeal cancer cell line CNE-1 were treated in vitro with different doses of radiation alone or radiation followed by HCPT (2 μg/ml) for 4 h. Colony forming assay was used for survival fraction analysis. Single-hit multitarget model was used to plot survival curve.ResultsThe value of D₀, D_q and N of BGC823 cells received radiation treatment alone was 1.17 Gy, 1.91 Gy and 5.14 respectively. That of BGC 823 cells received radiation plus HCPT was 0.95 Gy, 0.01 Gy and 1.01 respectively. The sensitization enhanecment (SER) ratio was 1.23(1.17/0.95). Similar results were obtained for CNE-1 cells treated with radiation alone or in combination with HCPT, with an SER of 1.68.ConclusionHCPT has been shown a radiosensitizing effect in vitro on gastric and nasopharyngeal cancer cells.

【Subject words】Hydroxycamptothecin; Radiotherapy; Radiosensitization

喜树碱(camptothecine CPT)是作用于拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)的抗癌药，临床已广泛应用。有关放射线与羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecinum, HCPT)联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用，尚未见报道。为此，我们应用鼻咽癌细胞系(CNE-Ⅰ)和胃癌细胞系(BGC-823)，对HCPT的放射增敏作用进行了研究。

材料与方法

一、细胞系及培养方法

人胃腺癌细胞系(BGC-823，由北京市肿瘤研究所提供)和人鼻咽癌细胞系(CNE-1，由广州中山医科大学提供)，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，取指数生长期细胞进行实验。

二、药物及给药方法

HCPT注射液由贵州中联药业有限公司贵州六枝大华制药厂出品。淡黄色液体，易溶于水。取指数生长期细胞接种于培养瓶中，根据实验要求，将药物用培养液配制成所需的浓度(0.1875，0.375，0.75，1.5，3.0，6.0，12.0 μg/ml，37℃作用4 h)，进行预实验，求得ID₅₀值，正式实验时，照射加药组按ID₅₀剂量给药。

三、照射方法

实验采用6 mV X线(瓦里安直线加速器)，剂量率2.5 Gy/min。培养瓶表面覆盖1.5 cm蜡板，源皮距 100 cm，根据实验要求进行不同剂量的照射。

四、实验分组及观察指标

1.HCPT对BGC-823细胞放射增敏作用的研究：实验分为单纯照射组和照射加药组。照射剂量分别为0，1，2，3，4，6，8，10 Gy。照射加药组在照射后均立即给予HCPT 2 μg/ml，37℃孵箱内作用4 h。

2.HCPT对CNE-Ⅰ细胞放射增敏作用的研究：实验分单纯照射组和照射加药组，照射剂量、给药剂量和实验方法均同BGC-823细胞。

全部实验中，各实验点均同时设置平行样本并重复2次。上述各实验组按实验设计完成照射及加药程序后，胰酶消化，计数细胞数，逐级稀释后将细胞接种在塑料平皿中。在37℃，5% CO₂孵箱内开放培养14 d后，用结晶紫染色，并进行克隆计数(计数＞50个细胞的集落)，计算细胞存活率，用计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数D₀、D_q、N值^［1］，最后求放射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER)。公式如下：

结果

图1显示了HCPT对BGC-823细胞的作用结果。单纯照射组D₀值为1.17 Gy，D_q值为1.91 Gy，N值为5.14；照射加药组D₀值为0.95 Gy，D_q值为0.01 Gy，N值为1.01；放射增敏比(SER)为1.23(1.17/0.95)。表明照射后给予HCPT对胃腺癌细胞具有放射增敏作用。图2显示了HCPT对CNE-Ⅰ细胞的作用结果。单纯照射组D₀值为1.60 Gy，D_q值为0.65 Gy，N值为1.5；照射加药组D₀值为0.95 Gy，D_q值为0.01 Gy，N值为1.01；SER为1.68(1.6/0.95)。表明照射后给予HCPT对鼻咽癌细胞具有明显的放射增敏作用。

图1BGC-823细胞HCPT+照射与单纯照射的细胞存活曲线

图2CNE-Ⅰ细胞HCPT+照射与单纯照射的细胞存活曲线

讨论

对于CPT及其衍生物的放射增敏作用，近年来国外已进行了大量的研究。本研究结果显示，HCPT对CNE-Ⅰ细胞系、BGC-823细胞系具有明显的放射增敏作用，SER分别为1.68和1.23。文献报道CPT及其衍生物的放射增敏作用，SER为1.1～2.3^［2-5］。

放射联合应用HCPT，一是使细胞存活曲线的D₀值降低，直接增加细胞对放射线的敏感性；二是抑制细胞对放射线所致的潜在致死损伤的修复(PLDR)和亚致死损伤的修复(SLDR)。放射联合应用HCPT，使细胞存活曲线的肩区消失(图1)，D_q值变小。文献报道，应用不同的细胞系和不同的TopoⅠ抑制剂，当与放射同时应用时，均显示有放射增敏作用。SER的变化范围在1.1～2.3，细胞存活曲线显示肩区缩短，存活区线的直线部分斜率增大。Lemond等^［2，3］提出，TopoⅠ抑制剂能够阻断放射线所造成的DNA断裂的修复，使可修复的单链断裂(SSB)变为不可修复的双链断裂(DSB)，形成TopoⅠ双链DNA复合物，导致细胞死亡。抑制DNA修复，导致细胞存活曲线肩区缩短，DNA损伤的改变则使得细胞存活曲线指数部分变得陡直。

离体研究显示，TopoⅠ抑制剂放射增敏作用具有如下特点：(1)药物的剂量-效应关系：在低剂量范围内，放射增敏作用随剂量增加而增加；而当达到一定的剂量浓度后，药物剂量增加，但放射增敏的作用减弱。(2)放射和CPT类药物的协同作用具有明显的时项依赖性：只有照射同时给药或照射后立即给药，才具有明显的细胞杀伤增强作用。(3)药物增强放射线的细胞杀伤作用具有不可逆转性：文献报道，当细胞受照射后给予10 μmol/L 9-氨基喜树碱(9AC)，在37℃条件下作用4 h，而后用PBS缓冲液清洗去除药物，加入含10%胎牛血清的培养液继续培养，并在此后的不同时间测定细胞存活率，结果显示，在去除药物之后仍然显示细胞杀伤作用的增强。同样，在CPT和β-lapachone的研究中，亦显示出具有增强放射线的细胞杀伤作用的不可逆转性^［2］。

TopoⅠ抑制剂在恶性肿瘤的治疗中具有巨大的潜在临床价值。实验及临床研究显示，TopoⅠ抑制剂具有广泛的抗瘤谱，对非周期细胞有放射增敏作用，这将有助于提高肿瘤的局部控制率。研究显示，许多肿瘤细胞中TopoⅠ的水平高于正常组织(包括结肠癌、食道癌、前列腺癌、非霍奇金氏淋巴瘤等)^［3］。这一现象具有重要的临床价值，在放疗合并CPT类药物的综合治疗中，可以选择性的加强对肿瘤细胞的杀伤作用，而正常组织的损伤则可相对减弱。

参考文献：

［1］糜福顺.细胞存活曲线.见：谷铣之，殷蔚伯，刘泰福，等主编.肿瘤放射治疗学.第1版.北京：北京医科大学北京协和医科大学联合出版社，1993.232-237.

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