关键词： TFAR19蛋白；乳腺肿瘤；细胞周期；细胞凋亡

【摘要】目的探讨细胞核内蛋白TFAR19对γ射线诱导的MCF-7细胞周期及凋亡的影响。方法用细胞形态学、荧光显微镜及激光共聚焦荧光显微镜、单细胞微凝胶电泳、流式细胞仪进行观察和检测。结果rhTFAR19 蛋白对γ射线诱导MCF-7细胞周期无明显作用。细胞周期特异性凋亡为G₂M期细胞凋亡。凋亡细胞形态表现为核碎裂，染色质边集，凋亡小体形成。单细胞电泳可显示典型的“彗星”，并通过形态变化区别坏死细胞和辨别荧光显微镜下难以识别的核碎裂凋亡细胞。结论rhTFAR19 蛋白对γ射线诱导的MCF-7细胞周期无明显影响，其对细胞凋亡的促进作用可能是通过放大或增强γ射线诱导细胞凋亡的信号产生。

Effect of rhTFAR19 protein on cell cycle and apoptosis of MCF-7 induced by γ-ray

JIAO Jianfeng, CHEN Guanying, HUANG Mei, et al.

（ Department of Radiation Medicion, Beijing Medical University, Beijing 100086, China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of protein product of TFAR19, an apoptosis-related gene previously cloned from leukemia cell line TF-1 cultured in medium deprived of growth factor, on cell cycle and apoptosis of human breast cancer induced by γ-ray.MethodsCell morphology, fluorescence microscopy, laser scanning confocal microscopy, single-cell gel electrophoresis (SCGE) and flow cytometry (FCM) were applied to study cell cycle and apoptosis of breast cancer cell line MCF-7.ResultsrhTFAR19 protein itself had no effect on cell cycle arrest and apoptosis of MCF-7 cell induced by γ-ray. When MCF-7 cells were pretreated with 10 μg/ml rhTFAR19 and then irradiated with 12 Gy γ-ray, cell apoptosis was observed. It was characterized morphologically by chromatin condensation, nucleoar disintegration, formation of apoptotic bodies, and typical “comet” on SCGE.ConclusionTFAR19 protein has no apparent effect on MCF-7 cell cycle induced by γ-ray. However, it synergizes with γ-radiation in the induction and enhancement of apoptosis.

【Subject words】TFAR19 protein;Breast neoplasms;Cell cycle;Apoptosis

TFAR19蛋白质是北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室发现的新的凋亡相关基因所表达的产物^［1］。凋亡相关基因TFAR19的cDNA已克隆出全长，并向Gen Bank登记。初步研究表明，TFAR19蛋白质在凋亡的TF-1细胞中高表达，用纯化rhTFAR19蛋白质能促进人滑膜细胞的凋亡，加速TF-1细胞去因子所致的凋亡。本实验旨在研究rhTFAR19蛋白对⁶⁰Co-γ射线诱导的人乳腺癌 MCF-7细胞系细胞周期变化、凋亡的细胞形态学特征及周期和凋亡关系的影响，以探讨rhTFAR19 蛋白在肿瘤的放射治疗中的应用前景。

材料与方法

1.细胞培养：人乳腺癌 MCF-7细胞系（北京医科大学病理学系黄玫博士惠赠）生长在含10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的RPMI 1640培养基（Gbico，USA）中，5% CO₂ 37℃饱和湿度培养箱内培养。

2.照射及rhTFAR19蛋白质：⁶⁰Co-γ射线照射源（本教研室钴源室提供），剂量率1.98～2.18 Gy/min，源靶距1.5 m，照射剂量2～12 Gy；rhTFAR19蛋白质（北京医科大学分子免疫室马大龙教授惠赠）为125个氨基酸，相对分子质量14 000，纯度99.70%，溶解于Tris.HCl，pH 9.8，工作浓度2.5～10 μg/ml不等。细胞处于指数生长期进行照射，照射前加rhTFAR19蛋白质，照射后继续培养，每个点均设单独照射组。

3.显微镜观察：加rhTFAR19蛋白质后照射，用胰酶/EDTA消化收集细胞，70%乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，离心涂片，荧光显微镜及激光共聚焦荧光显微镜（Leica TCS NT）观察，数码照相机拍照。

4.单细胞微凝胶电泳——彗星试验：10 μg/ml rhTFAR19蛋白质+12 Gy γ射线照射，照后48 h消化收集细胞，70%乙醇固定，取10²～10³个细胞悬浮于0.5%低熔点凝胶的载玻片。经碱裂解（裂解液含2.5 mmol/L NaCl、100 mmol/L Na₂EDTA、10 mmol/L Tris.Cl、1% 肌氨酸钠，临用前加1% Trton X-100）1 h。4℃电泳（碱性缓冲液含1 mmol/L Na₂EDTA、300 mmol/L NaOH ）20 min，电压120 V，电流300 mA。5 μg/ml PI染色，激光共聚焦荧光显微镜观察，488 nm波长激发光激发，发射光为红色，用数码照相机拍照。

5.流式细胞术分析：细胞固定于70%乙醇18 h以上，PBS洗2遍，0.5 ml PBS重悬细胞，加RNase，终浓度100 μg/ml。置37 ℃恒温水浴箱，温浴30 min。测前30 min加PI终浓度5 μg/ml染色，流式细胞仪用BD.FACS can (Becton Dickinsan) ，汞灯488 nm波长激发光激发。以cellfit软件分析周期，LysisⅡ分析凋亡。

6.rhTFAR19蛋白质定位实验：指数生长期细胞，胰酶/EDTA消化，取1×10⁴个细胞放入5 ml离心管，PBS洗2遍，加入rhTFAR19蛋白-FITC 50 μl，4℃孵育30 min，混匀后取1滴滴片，488 nm波长激发光激发，发射光为绿光。

结果

一、形态学观察

rhTFAR19蛋白- FITC位于细胞核，呈浓绿色（图1）。细胞经10 μg/ml rhTFAR19蛋白质+12 Gy γ射线照射发生凋亡，出现核碎裂，染色质边集，凋亡小体等(图2)。单细胞电泳可见典型的“彗星尾” （图3），还可见核碎裂。核碎裂块较大，块间裂隙较小，如不电泳可能核碎裂的表现不明显，电泳后块间裂隙加大，呈现典型的凋亡表现。此时“彗星”不明显是因为小片段DNA较少（图4）。

二、流式细胞仪分析

1.rhTFAR19蛋白质浓度梯度：0，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/ml单独应用时，细胞周期和凋亡无明显改变。

2. 5 μg/ml rhTFAR19蛋白质+2 Gy γ射线照射：以2 Gy γ射线照射为对照，分别于照射前加5 μg/ml rhTFAR19蛋白质，在4，8，12，24，48 h进行细胞周期及凋亡的检测，细胞周期变化同单独2 Gy γ射线照射，凋亡细胞也无明显增加。

3. 10 μg/ml rhTFAR19蛋白质+2，4，8，12 Gy γ射线照射：细胞周期改变以G₂M期阻滞为主，12 Gy为13.1%，但明显少于单独γ射线照射的27.2%。细胞凋亡有明显的量效关系，特别是加12 Gy γ射线照射,凋亡明显增加，达30.9%。

图1 rhTFAR19蛋白质-FITC们于细胞核,细胞核内深染绿色.荧光显微镜观察 ×400 488nm 图2 10μg/ml rhTFAR19+12Gy 照射,凋亡细胞出现染色体边集、核碎裂及凋 亡小体。激光共聚焦荧光显微镜观察 PI 染色 488nm 图3 单细胞微凝胶电泳后，凋亡细胞出现典型的“彗星”，H为彗星头，T为彗星尾。激光共聚焦荧光显微镜观察 PI染色 488nm 图4 单细胞微凝胶电泳后，凋亡细胞核碎裂块这间出现裂隙，从形成上也可辨别凋亡细胞。激光共聚焦荧光显微镜观察 PI 染色 488nm

讨论

TFAR19蛋白质是TF-1细胞凋亡早期过程发挥作用的、凋亡相关基因所表达的凋亡相关蛋白。rhTFAR19蛋白为凋亡促进剂而非诱导剂，对细胞生物学特性影响较小，单独使用对细胞无毒性作用。

研究结果表明：单独使用各浓度的rhTFAR19蛋白质，细胞周期无明显改变；rhTFAR19蛋白质不影响辐射引起的周期改变，在5 μg/ml及10 μg/ml的情况下，周期改变同单独γ射线照射。这也说明TFAR19蛋白质无明显的细胞毒性作用。

在10 μg/ml rhTFAR19蛋白质浓度时，随γ射线照射的剂量增加，细胞凋亡的比例逐渐增加，在12 Gy时明显增加，这一点说明γ射线在诱导凋亡中起决定作用。我们同时也做了增加蛋白浓度，减少射线剂量的实验：15 μg/ml rhTFAR19蛋白质加8 Gy γ射线照射，凋亡细胞的比例为21.99%；10 μg/ml rhTFAR19蛋白质加8 Gy γ射线照射，凋亡细胞的比例为15.65%，说明rhTFAR19与细胞凋亡可能存在一定的量效关系。

细胞周期改变趋势，总的来说是因γ射线引起的G₂M期阻滞，随照射剂量的增加而增加。加蛋白与单独照射相比，比例有所减少，在12 Gy时最明显。细胞凋亡的发生，随剂量的增加而增加，在12 Gy时最明显，考虑可能是因G₂M期这一部分细胞发生了凋亡，致使其比例下降。既往报道增殖细胞对某些诱导凋亡的因素有周期依赖敏感性，即所谓发生周期特异性凋亡。Gorcezyca等^［2］报道HL-60细胞经紫外线灯照射，在G₁