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【摘要】目的克隆和表达一种新的血管形成抑制因子，并研究其抗肿瘤活性。方法应用逆转录聚合酶链反应从人胎儿肝脏组织中克隆到一种新的血管形成抑制因子（human inhibiting angiogenesis factor-1，HIAF-1)，经测序后克隆到表达载体pET30a(+)上，在E.coli BL21∶DE3菌中表达。用MTT法体外检测HIAF-1对内皮细胞的作用，采用小鼠乳癌自发性肺转移模型IVTA2 MA-891，体内研究重组蛋白对肿瘤血管形成的作用和抑瘤作用。结果从胎儿肝脏组织中首次克隆到人源血管形成抑制因子HIAF-1，经测序为人胶原ⅩⅧ C-末端的一部分。在E.coli细胞中高效表达了该因子的重组蛋白，蛋白表达量为88 mg/L。体外实验表明HIAF-1能抑制内皮细胞的增殖，IC50值为7.5 μg/ml。动物实验表明该重组蛋白能够显著抑制肿瘤血管形成，原发瘤的生长（抑瘤率为46.6%）及肿瘤的转移（抑制转移率为68.9%）。结论成功的克隆了血管形成抑制因子HIAF-1，其能够抑制肿瘤血管的形成，在肿瘤的治疗中显示出良好的应用前景。
Cloning and antitumor activity of angiogenesis inhibitor HIAF-1
GUO Wenzhong, YANG Zhihua, LIU Jun, et al.
（ Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）
【Abstract】ObjectiveA new angiogenesis inhibitor HIAF-1 (human inhibitor angiogenesis factor-1) was cloned, expressed in E. coli and its antitumor activity was studied.MethodsHIAF-1 was amplified by RT-PCR from human fetal liver tissue,then cloned into pET30a(+) vector and expressed in E.coli BL21:DE3 after sequencing. In vitro endothelial proliferation inhibiting activity of HIAF-1 was examined by MTT method. In vivo antitumor activity was studied in a murine model of IVTA2MA-891.ResultsHIAF-1 was first cloned from human fetal liver tissue. Sequence analysis of the inhibitor revealed identity to a c-terminal fragment of human collagen XVIII. HIAF-1 was effectively expressed in E. coli with a yield of 88 mg/L. Recombinant HIAF-1 protein could inhibit endothelial cell proliferation in vitro with an IC50 value of 7.5 μg/ml. In vivo studies showed that HIAF-1 inhibited growth rate of the primary tumor by 46.6% and metastasis by 68.9%.ConclusionThe cloned and the bio-engineering product of HIAF-1 is an angiogenesis inhibitor,capable of inhibiting tumor growth and metastasis.
【Subject words】Angiogenesis inhibitor-1; Neoplasm angiogenesis; Gene cloning; Neoplasm metastasis
大量的研究表明，抑制新生血管的形成、能够抑制实体瘤的生长和转移。近年来已分离到一些抑制血管形成的因子具有抑制肿瘤血管形成活性，有望成为新的肿瘤治疗药物［1］。我们从人胎儿肝脏组织中克隆到了一种人源的血管形成抑制因子（human inhibiting angiogenesis factor-1，HIAF-1），并在原核细胞中获得了高效表达。动物实验表明，原核重组的HIAF-1能显著抑制肿瘤血管的形成，原发瘤的生长和肿瘤的转移。
材料与方法
1.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HIAF-1：用TRIzol Reagent试剂盒（Gibco BRL公司），从流产的正常胎儿肝脏组织提取总RNA，逆转录为cDNA，用自行设计的PCR引物扩增HIAF-1，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.HIAF-1的克隆及序列测定：PCR产物电泳分离后，用DNA快速纯化试剂盒（ClonTech公司），回收纯化580 bp左右大小的目的带。将纯化的目的片段克隆到pUC18载体中。从获得的重组克隆中选择含有目的基因的3个阳性克隆，用DNA纯化柱（Qiagen公司的Miniprep）提取大量高纯度的DNA，用双脱氧链终止法在ABI的自动测序仪上进行测序分析。
3.HIAF-1原核表达载体的构建及表达：酶切含HIAF-1的重组pUC18质粒DNA，电泳回收HIAF-1片段，将其克隆到含有(His)6标记的表达载体pET30(+)上，重组质粒DNA先转化大肠杆菌DH5α。经酶切鉴定正确的阳性克隆，再转化表达宿主菌BL21：DE3，挑取转化的单克隆经扩大培养后，用IPTG进行诱导表达，诱导表达的培养物经超声破菌，沉淀下包涵体。用SDS-PAGE电泳分析，确定目标蛋白的分子量，并用抗(His)6抗体(Qiagen公司)进行Western blot鉴定表达产物。
4.MTT法体外检测HIAF-1对内皮细胞和肿瘤细胞的作用：HIAF-1包涵体洗涤后，尿素变性经凝胶过滤复性并纯化，用培养基稀释成不同浓度备用。接种相同数目的牛大动脉内皮细胞系ABAEC和肝癌7 402细胞系（本室保存）于96孔板中，加不同浓度的HIAF-1作用48 h后（期间换液1次）加MTT继续培养4 h，加DMSO(二甲基亚砜)溶解细胞，490 nm测吸光度(A值，曾称光密度OD值)，参照文献［2］计算IC50值。
5.HIAF-1体内抑制肿瘤血管形成及肿瘤生长转移的动物实验：采用小鼠乳癌自发性肺转移模型IVTA2 MA-891［3］，将IVTA2 MA-891肿瘤研磨制成单个肿瘤细胞接种12只津白Ⅱ小鼠后腿皮下，每只1×107细胞，48 h后随机分为2组，每组6只，一组皮下注射诱导表达经洗涤后的HIAF-1包涵体，每只50 mg/kg体重，隔天注射1次，持续24 d；另一组皮下注射同量诱导表达的空载体，隔天1次，持续24 d。当空载体组长出原发瘤后，每3 d用游标卡尺测量瘤表面最长的纵轴（长）及与该轴垂直的一个短轴（宽），按体积=长×(宽)2×0.4计算瘤近似体积，作生长曲线，同时记录体重。停止注射后2 d杀死动物，称取小鼠体重、原发瘤重、肺重，计数肺部转移灶数目并观察其大小。按抑瘤率=（1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%计算原发瘤抑瘤率，按抑制率=（对照组平均转移灶数-给药组平均转移灶数）/对照组平均转移灶数×100%计算抑制转移率。同时按薛克勋等［4］描述的分级标准观察肺转移程度。取原发瘤及小鼠肺做石蜡组织切片，按参考文献［5］用FVⅢ-RA多抗（Zymed公司）为一抗，羊抗兔-HRP为二抗进行免疫组化染色。选取具有代表性的组织切片，排除肿瘤出血区及边缘反应区，低倍镜下（×40）观察确定切片中血管密度最高区域（热点区域），然后高倍镜下（×100）由2位观察者计数20个视野中肿瘤内微血管数目，以平均每高倍镜（×100）视野血管个数表示微血管密度（microvessel density count MDC）。
结果
1.人胎儿肝脏组织中HIAF-1的扩增：从人胎儿肝组织中提取总RNA，进行RT-PCR反应，结果从胎儿肝脏cDNA中扩增出大约580 bp的单一条带。
2.HIAF-1的克隆及核苷酸序列测定：回收纯化PCR产物中的目的带，与pUC18载体连接构建重组克隆载体。酶切鉴定重组克隆，共获得6个目的重组克隆。选择其中3个克隆进行序列测定，测得3个克隆序列完全相同，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列经与Genebank比较，发现其为人胶原XVⅢ C-末端的一部分，与鼠源Endostatin 86%同源，由183个氨基酸组成。
3.HIAF-1原核重组表达载体的构建及表达：从重组pUC18载体中酶切回收HIAF-1片段，将其定向克隆到载体pET30a（+）的BamH Ⅰ下游，转化BL 21∶DE3菌株，挑取其中的克隆诱导表达，同时挑取不含载体的BL21空菌菌落和转化有pET30a(+)空载的BL21菌落，进行诱导。诱导后各取菌体直接进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明，重组克隆高表达HIAF-1融合蛋白，分子量约26 000，表达量约占整个菌体的20%～30%。制备包涵体，包涵体用PBS重悬，取适量进行SDS-PAGE电泳，并用抗(His)6抗体做Western blot分析。结果表明，重组克隆表达HIAF-1融合蛋白，分子量为26 000，而BL21空菌和含空载的BL21菌没有该重组蛋白表达。经分光光度计测定，HIAF-1的表达产量为88 mg/L菌液。
4.HIAF-1体外对内皮细胞及肿瘤细胞的作用：HIAF-1对培养的内皮细胞系有显著的抑制作用，粗制品的半数抑制量IC50约为7.5 μg/ml，HIAF-1对培养的肿瘤细胞没有明显的作用。
5.HIAF-1的体内抑制血管形成和抑瘤抗转移活性：皮下接种IVTA2MA-891肿瘤细胞，待长出肿瘤后每3 d测一次肿瘤大小，绘制实验组和对照组肿瘤的生长曲线，曲线显示HIAF-1显著抑制肿瘤的生长。第34 d处死小鼠，称体重、原发瘤重，测原发瘤大小、肺重并计数肺转移灶个数（表1），结果显示，HIAF-1显著抑制原发瘤的生长，抑瘤率为 46.6%。HIAF-1也显著抑制肿瘤的肺转移，抑制转移率为68.9%，按薛克勋的分级标准，实验组6只小鼠中，1只肺转移程度属Ⅰ级，3只属Ⅱ级，仅2只肺内有广泛散在的小转移灶属Ⅲ级，而对照组除2只属Ⅲ级外，其他4只肺内呈广泛转移灶，占全肺1/2以上，有些转移灶融合在一起，分级程度属IV级。实验组和对照组小鼠体重变化不大，间接表明HIAF-1治疗没有明显的毒性。肿瘤内微血管密度计数表明，HIAF-1显著抑制原发瘤中血管形成（表1）。
表1HIAF-1的抑瘤抗转移动物实验结果(
