关键词： 髓母细胞瘤药物疗法；Fas/FasL配体；细胞凋亡；维甲酸/治疗应用

【摘要】目的观察经全反式维甲酸（RA）诱导分化的髓母细胞瘤细胞系Med-3对顺铂（DDP）的化疗敏感性，死亡性质及其内在的分子机制。方法分析RA、DDP和两者配伍对Med-3细胞形态和增殖的影响，观察被处理细胞的死亡特点并检测各处理因素对凋亡相关基因Fas和Fas配体（FasL）表达水平和表达方式的影响。结果可溶型和膜型FasL在正常培养和被处理的Med-3细胞中均呈阳性，Med-3细胞产生可溶型Fas并呈胞浆阳染。与DDP不同，RA可明显上调Fas表达并使Fas蛋白从胞浆移至细胞表面；但仅在它与DDP联用时，才能诱导靶细胞凋亡。结论分化诱导剂RA通过修饰Fas基因表达形式，提高髓母细胞瘤Med-3细胞对DDP的凋亡敏感性。RA/DDP配伍方案可能成为临床治疗髓母细胞瘤的新途径。

Retinoic acid enhances chemosensitivity of medulloblastoma cells in vitro and its potential mechanism

LIU Jia, GUO Li, LIU Ning, et al.

（ Division of Molecular Biology, Shenyang Medical College, Shenyang 110031, China）

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the chemosensitivity of retinoic acid (RA)-differentiated medulloblastoma Med-3 cells to conventional anti-cancer drug and to determine the potential genetic factor(s) mediating this sensitivity.MethodsTen μmol/L RA, 5 μg/ml cisplatin (DDP) and their combination with one half concentration of each were used respectively to treat human medulloblastoma cell line Med-3 in vitro. Cell proliferation, morphology and death pattern as well as Fas/FasL expressions were analyzed by multiple approaches.ResultsBoth soluble and membrane FasL could be detected in the treated and untreated Med-3. Fas was positive in the cytoplasm of Med-3 cells and the cells could produce soluble Fas. DDP had no obvious effect on Fas expression. RA up-regulated Fas expression and translocalization from cytoplasm to cell membrane of the treated cells. Neither RA nor DDP could trigger apoptosis but in combination could effectively induce apoptosis.ConclusionRA could enhance the apoptotic susceptibility of Med-3 cells to DDP presumably through modulating the Fas expression pattern. Combined RA/DDP regimen would have potential clinical value in the management of medulloblastomas.

【Subject words】Medulloblastoma/drug therapy; Retinoic acid/therapeutic use; Fas/Fas ligand; Apoptosis

由于髓母细胞瘤生长速度快，颅内扩散力强，对常规放疗和化疗很不敏感，故术后极易复发，预后甚差^［1］。因此，在早期发现和及时治疗的同时，寻求较为有效的辅助性治疗手段具有现实的临床肿瘤学意义。

近来发现，分化诱导剂全反式维甲酸（RA）在抑制白血病抑制因子（LIF）表达和端粒酶活性的同时，促进髓母细胞瘤细胞系Med-3再分化^［2］。但RA不诱导Med-3细胞凋亡且其作用有明显的可逆性。可见，单纯使用RA很难达到有效杀伤髓母细胞瘤的目的。来自其他类型肿瘤的研究结果表明，有些趋于分化的癌细胞较其前体细胞有更高的化疗和(或)凋亡敏感性^［3］，但尚未发现有关髓母细胞瘤的此类报道。为此，我们将促分化剂RA和常规化疗药顺铂（DDP）相结合，处理髓母细胞瘤细胞Med-3并观察被处理细胞在增殖、生存和凋亡相关基因Fas/FasL表达方面的改变。

材料与方法

1．细胞的培养和处理：人髓母细胞瘤细胞系Med-3由日本神户大学医学部神经外科建立和惠赠。细胞培养在37℃，5% CO₂和含10%胎牛血清的伊格尔培养基（Eagle′s MEM）中，RA（Sigma，USA）用99%背景对照（DMSO）配制成最终浓度为100 mmol/L的储备液，DDP（日本山之内制药株式会社）则用培养液配成浓度为500 mg/ml的储备液。实验分4组，每组设8皿。第1组正常培养；第2组10 μmol/L RA; 第3组5 μg/ml DDP；第4组5 μmol/L RA与2.5 μg/ml DDP配伍。将15张左右灭菌盖玻片放入皿中，细胞均匀铺皿。每隔24 h从各皿取盖玻片若干，用于各项检测，持续观察5 d，每项实验至少重复3次。

2．细胞形态学和增殖动力学观察：采用的主要方法为H/E染色、细胞总数及死活细胞比值和反映细胞增殖以及DNA合成情况的MTT比色法。实验步骤按以往所述^［2］。

3．细胞死亡性质和凋亡指数的确定：取细胞盖玻片，每组3张。多聚甲醛固定后，使用末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法（TUNEL）做原位DNA片段化分析。根据细胞核、质、膜的状态和凋亡小体形成与否，判定细胞死亡性质。从每张片选5个视野（×40），分别记录每100个胞核中有凋亡改变者所占的比例，综合分析之。

4.Fas和FasL的免疫组织化学（ICC）染色和Western印迹杂交：药物处理后第1，2，3，4和5 d，取细胞盖玻片，冷丙酮（-20℃）固定后，按常规实验步骤做Fas和FasL的ICC染色。未经1抗作用的细胞用做背景对照。收集皿内剩余细胞，常规制备细胞裂解液并将工作浓度调至5 μg/μl。Western印迹杂交的简要步骤是：10 μl蛋白样本在6%聚丙烯酰胺凝胶内电泳分离，经转膜器移至PVDF（Gelman, USA）滤膜；滤膜用5%脱脂乳PBS液封闭后，在室温下与兔抗人Fas或FasL抗体（Santa Cruz, USA）和辣根过氧化物酶标记的猪抗兔IgG（Dako, Denmark）孵育。每次孵育后，均用含0.02% Tween20的PBS洗脱3次，经放射自显影，显示被化学荧光增强液ECL（Amersham,UK）标记的结合信号。

结果

细胞形态学和生长动力学观察发现，RA、DDP及两者的配伍对Med-3细胞有不同的生物学效应。10 μmol/L RA处理后，细胞生长变缓，形态由圆形少突演变成梭形突起多而长，贴壁能力明显减弱。上述改变在处理后第48～72 h最明显，而后逐渐减弱，在第5 d，细胞基本恢复至原有形态，该组的TUNEL（+）细胞十分罕见。DDP处理的细胞生长减慢但无分化样形态学改变，可见少量TUNEL（+）细胞，DDP的药效可持续4～5 d。RA和DDP联合处理组，除增殖速度明显减慢外，还出现大量TUNEL（+）细胞，被处理细胞在96 h内全部死亡。处理后第72 h的凋亡指数显示：正常培养组为1.2%；RA处理组为2.1%；DDP组为6.5%；RA/DDP组为78%。与单纯RA和DDP处理相比，两者的配伍对Med-3细胞有十分显著的诱导凋亡作用（P＜0.01，t检验）。

ICC染色显示，正常培养的Med-3细胞，FasL呈阳性，以胞浆着色为主，各处理因素对其表达无明显影响。Fas在Med-3中亦呈阳性，存在于胞浆中。单纯5 μg/ml DDP处理略使阳染加深但仍以胞浆为主。10 μmol/L RA处理的细胞则显示Fas蛋白不但在水平上明显提高，而且其分布也与前两组细胞差异有显著性，即靶蛋白在胞膜阳染，形成独特的“镶边”现象。该现象在5 μmol/L RA、2.5 μg/ml DDP联合处理组更为明显，即凋亡细胞乃至凋亡小体表面呈Fas强阳性。鉴于上述4组细胞的染色条件完全相同且省略一抗染色的各组细胞均呈阴性，故可排除“镶边”现象系“边缘效应”所致的可能性。

Fas和FasL的Western印迹杂交显示（图1）：正常培养组细胞产生3种分子质量的Fas蛋白，即Mr 30 000，45 000和60 000，但以前两种为主；DDP处理组的Fas表达形式与前者相似但有所上调；在10 μmol/L RA组，Mr 30 000和45 000 Fas蛋白的含量减少，而60 000却明显提高，并出现更大的额外蛋白条带；5 μmol/L RA+2.5 μg/ml DDP组的Fas产生形式与组3相似但水平偏低。各组细胞均有Mr 37 000膜型和24 000可溶型FasL存在，且表达水平差异无显著性。

1为正常培养；2为DDP处理；3为RA处理；4为RA/DDP半量处理

1不同条件下培养48 h的Med-3细胞内，Fas表达情况的Western印记杂交

讨论

为了解RA分化后的髓母细胞是否象其他类型癌细胞那样，对化疗或凋亡的敏感性有所增强，我们使用RA、DDP和两者的半量配伍，分别处理Med-3。结果表明，尽管RA和DDP能抑制细胞生长，RA还在一定时间范围内促使Med-3成熟分化，但两者均未显示出有效的细胞杀伤效应。相反，RA/DDP的半量配伍却使被处理细胞在较短时间内死于凋亡。由于RA和DDP对某些肿瘤细胞有凋亡诱导作用^［4,5］，故本实验结果再次证实，髓母细胞对常规化疗更具耐受性；实验结果还进一步提示，尽管RA本身不诱导髓母细胞凋亡，但能通过促进靶细胞分化来增强DDP的凋亡诱导作用。

已知某些分化后的癌细胞较其前体细胞有更高的化疗或凋亡敏感性，但引起该现象的分子机制却不明确。近来发现，Fas (CD95/Apo-1) 蛋白的凋亡调节作用既取决于与其配体FasL的相互作用，也与它的表达形式有关^［6，7］，即mFas与其配体FasL和癌基因c-myc一道在细胞表面构成调控凋亡的分子开关^［6］