肝癌细胞对化疗药物产生了多药耐药性是大部分肝癌患者化疗效果不佳的主要原因。我们动态研究了阿霉素(ADM)诱导肝癌细胞株耐药性的产生以及多药耐药相关蛋白(MRP)基因在其中的作用。

一、材料与方法

1.耐药细胞诱导：(1)用逐步增加RPMI-1640培养基中ADM浓度的方法诱导肝癌细胞SMMC-7721产生耐药性。起始浓度0.005 μg/ml，终浓度为0.05 μg/ml。分别使细胞在ADM浓度为0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.03 μg/ml、0.04 μg/ml、0.05 μg/ml的培养基中稳定生长8周，分别称为S1、S2、S3、S4、S5细胞；(2)将S2和S5细胞置于不含ADM的培养基中分别培养4周和8周。

2.体外药物敏感试验：用台盼蓝排染活细胞计数法，测定亲代及各耐药细胞的药物半数有效量IC₅₀值，确定各耐药细胞的耐药倍数RF。

3.MRP基因表达检测：收集对数生长期细胞，半定量RT-PCR法测定MRP mRNA的表达，以MRP mRNA/β₂m mRNA的比值表示MRP的表达水平。

4.细胞对柔红霉素(DNR)的摄取率：根据DNR可自发红色荧光的原理，将各对数生长期细胞于DNR浓度为2 μg/ml的培养基中培养45 min后，收集细胞，PBS洗两次，用流式细胞仪检测细胞内红色荧光强度，以荧光指数FI代表细胞内DNR浓度。

5.统计学处理：组间比较用t检验，结果用±s表示。

二、结果

1.细胞的体外药物的敏感性：随着ADM诱导浓度的逐步增高，各耐药细胞亚株的IC₅₀值逐步增高(P＜0.05)，其中亲代细胞IC₅₀为(0.003±0.0006) μg/ml，S1～S5细胞IC₅₀分别为(0.022±0.004) μg/ml、(0.052±0.009) μg/ml、(0.078±0.008) μg/ml、(0.10±0.015) μg/ml和(0.126±0.016) μg/ml，RF也逐步增高，S5细胞为41.8倍。撤药4周后，S2和S5两个耐药细胞亚株的IC₅₀分别为(0.034±0.008) μg/ml和(0.091±0.008) μg/ml，撤药8周后，S2和S5两个耐药细胞亚株的IC₅₀分别为(0.021±0.007) μg/ml和(0.043±0.006) μg/ml，耐药倍数RF有着明显的下降(P＜0.05)。

2.MRP基因表达：亲代细胞MRP mRNA/β₂m mRNA的比值为0.53±0.049，S1～S5细胞mRNA/β₂m mRNA的比值分别为1.06±0.087、1.51±0.10、2.04±0.13、2.74±0.21和3.12±0.19。撤药4周后，S2和S5两个耐药细胞亚株mRNA/β₂m mRNA的比值分别为0.98±0.032和1.13±0.09；撤药8周后其比值分别为0.66±0.028和0.8±0.09。

3.细胞对DNR的摄收率：亲代细胞FI值为5.72±0.52，S1～S5细胞FI值分别为2.30±0.16、2.15±0.06、1.18±0.06、0.12±0.01和2.39±0.28。撤药4周后，S2和S5两个耐药细胞亚株FI值分别为4.9±0.15和3.79±0.042；撤药8周后其FI值分别为5.13±0.76和6.33±0.30。

三、讨论

MRP基因过度表达是肝癌等肿瘤免受化疗药物攻击最重要的细胞防御机制之一。本研究显示，用逐步增加ADM浓度的培养基培养肝癌细胞，随着ADM浓度的提高，MRP表达水平逐步增高(P＜0.05)，细胞的IC₅₀和RF值也逐步升高，细胞的耐药性增加。撤药后，细胞的MRP表达明显下降，细胞对化疗药物的敏感性也逐渐恢复。研究还表明，撤药前MRP表达水平越高，撤药相同时间后，MRP表达下降的程度越大。提示化疗药物ADM可以通过诱导SMMC-7721细胞过度表达MRP而产生耐药性。

DNR是MRP的蛋白产物P-190比较特异的作用底物^［1］，通过对细胞内DNR浓度的检测，可间接了解MRP表达升高使得细胞产生耐药性的机理。本研究表明，随着各耐药细胞MRP表达的增高，细胞内DNR浓度逐渐下降，但在S5细胞中DNR浓度只有部分降低，这是由于P-190主要位于细胞内质网膜上，也有少部分位于细胞膜，其具有ATP依赖“药泵”作用，可将细胞内DNR排出细胞外，使得细胞内DNR总浓度下降。此外，P-190还可使DNR在细胞内重分布：DNR在敏感细胞主要位于核内，而在耐药细胞中，P-190能将核内DNR转运至核外，高尔基体和溶酶体内，使得细胞内DNR下降不明显，但核内DNR浓度明显下降，从而避免了DNR对细胞的毒性作用，肿瘤细胞获得耐药性。然而，P-190这两种作用机理中哪一种是主要的还不十分清楚，可能是共同起作用。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770723)

参考文献：

［1］Paul S, Belinsky MG, Shen H, et al. Structure and in vitro substrate specificity of the murine multidrug resistant-associated protein. Biochem, 1996,35：13647-13655.

收稿日期：1999-04-09