关键词： 冷冻外科；肿瘤/免疫学；围手术期；黑色素瘤/治疗

【摘要】目的通过动物实验总结冷冻外科联合生物免疫治疗恶性肿瘤的经验，为临床应用提供依据。方法将接种黑色素瘤B₁₆的荷瘤小鼠C₅₇BL/6随机分为冷冻免疫治疗组(实验组)、冷冻对照组、免疫对照组、盐水对照组。实验组在围冷冻手术期，去除免疫抑制，配合生物免疫治疗，强化抗肿瘤免疫作用；其他3个对照组分别进行冷冻治疗、免疫治疗、注射生理盐水。治疗后比较各组疗效。结果肿瘤接种后第35天，实验组、冷冻对照组、免疫对照组、盐水对照组肿瘤体积分别为0.4，1.1，1.9，3.9 cm³。若按90天计算生存期，实验组与冷冻对照组、免疫对照组、盐水对照组的生存期分别为71，62，53，46天。免疫对照组和盐水对照组无一例治愈；冷冻对照组的7只小鼠中有1只治愈；实验组的6只小鼠中有3只治愈。治愈小鼠3个月后人为处死，原肿瘤部位组织切片经光镜、电镜检查均未见肿瘤细胞，其疗效明显优于其他各对照组(P＜0.05)。多次重复上述实验结果一致。结论单纯冷冻或单纯免疫治疗非免疫原性肿瘤能减缓肿瘤的发展，但治愈率极低。若两种治疗方法联合应用，发挥优势互补，将明显提高疗效。

Antitumor effect of peri-cryosurgical immunotherapy

ZHANG Baoning, ZHANG Shuren, QU Ping, et al. Cancer Institate (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the anti-tumor effect of combined cryosurgery and immunotherapy in mice.MethodsC₅₇BL/6 mice bearing B₁₆ melanoma were randomly divided into 3 groups: (1) peri-cryosurgical immunotherapy group, (2) cryosurgery group, (3) immunotherapy group and (4) saline group.ResultsThe tumor size on day 35 was 0.4 cm³ in group 1, 1.1 in group 2, 1.9 in group 3, and 3.9 in group 4 of mice. The survival period was 71, 62, 53 and 46 days, respectively. None in group 3 and 4 was cured, while 14% of mice in group 2 and 50% in group 1 were tumor tree. In tumor-free mice, no tumor cell in the primary tumor sites was found by light and electron microscopy 3 months later.ConclusionThe combined use of cryosurgery and immunotherapy is curative in 50% of mice bearing established B₁₆ melanoma.

【Subject words】CryosurgeryNeoplasms/immunologyPerioperationMelanoma/therapy

冷冻治疗肿瘤已有数十年的历史。近年来，随着冷冻设备的更新和冷冻技术的完善，在准确定位肿瘤和最大限度地杀灭肿瘤组织等方面取得了长足的进步。对不宜行肿瘤切除手术的患者，冷冻疗法不失为治疗的又一选择。而肿瘤的生物免疫治疗也极为活跃，这是由于免疫学在提示抗原呈递、T细胞识别、肿瘤抗原等方面有了重大突破。然而，治疗恶性肿瘤采用单纯冷冻治疗和单纯免疫治疗疗效有限。在肿瘤围冷冻治疗期联合应用免疫治疗，充分调动两种疗法的优势互补，在动物实验中取得了极为可喜的结果，现报告如下。

材料与方法

1.材料：实验动物：C₅₇BL/6小鼠；接种肿瘤：非免疫原性小鼠黑色素瘤B₁₆；冷冻设备：英国LCS-3000深度冷冻治疗机；实验用药：干扰素(IFN-α，美国先灵葆雅公司产品)、白细胞介素-2(rIL-2，军事医学科学院四环药厂产品)、环磷酰胺(CTX，山东齐鲁药厂产品)。

2.方法：将黑色素瘤B₁₆1×10⁵细胞接种于C₅₇BL/6小鼠的侧腹壁上，将荷瘤小鼠随机分成4组：1个实验组：冷冻免疫治疗组(6只)；3个对照组：冷冻对照组(7只)、免疫对照组(6只)、盐水对照组(7只)。接种后第17天，肿瘤直径达3～5 mm时，对实验组和冷冻对照组小鼠进行冷冻外科治疗，注射苯巴比妥钠进行术前麻醉，于瘤旁切开皮肤，用冷冻治疗机细探头插入肿瘤组织内进行冷冻，平均冷冻时间1分30秒，冷冻温度-50℃，冰球复盖全部肿瘤。实验组小鼠于冷冻治疗前3天(即接种后第14天)，腹腔注射1次CTX 1 mg，以去除免疫抑制；冷冻前2天于肿瘤局部每天注射1次IFN-α 5万U；冷冻治疗当天起于肿瘤局部与腹腔每天交替注射rIL-2 1万U，连续10天。冷冻对照组和免疫对照组分别单纯进行冷冻治疗和免疫治疗，方法同上。盐水对照组不注射CTX、IFN-α和rIL-2，仅注射生理盐水。

结果

肿瘤接种后第35天，盐水对照组、免疫对照组、冷冻对照组和冷冻免疫实验组小鼠肿瘤的平均体积分别为3.9，1.9，1.1，0.4 cm³(图1)。免疫对照组、冷冻对照组肿瘤大小明显小于盐水对照组，但统计学处理差异无显著性(P＞0.05)；而实验组与盐水对照组相比，肿瘤大小差异有显著性(P＜0.05)。按90天计算生存期，盐水对照组、免疫对照组、冷冻对照组和冷冻免疫实验组生存期分别为46，53，62，71天(图2)。盐水对照组、免疫对照组均无一例治愈；冷冻对照组的7只小鼠中有1只治愈；实验组有3只小鼠生存均超过90天。实验组治愈小鼠原肿瘤部位组织切片经光镜检查未见肿瘤细胞，仅见中性白细胞、纤维细胞和淋巴细胞，经电镜放大4 000倍、7 000倍仅见大片坏死；而盐水对照组镜下可见生长活跃的肿瘤细胞，其他对照组均较实验组差。以相同数量的小鼠多次重复上述实验结果一致。

图1治疗后荷瘤小鼠肿瘤的体积

图2治疗后荷瘤小鼠的生存期

讨论

冷冻手术可直接破坏肿瘤组织，产生凝固性坏死，但并不破坏蛋白水平上的肿瘤抗原，因而为诱导激发免疫系统提供了良好的条件。我们在冷冻治疗围手术期应用CTX去除免疫抑制细胞，同时应用IFN-α、rIL-2，调节肿瘤抗原的呈递作用，并强化抗肿瘤免疫，取得了可喜的治疗效果。实验结果显示，冷冻免疫联合治疗组(实验组)肿瘤发展明显受到抑制，生存期显著延长，50%的荷瘤小鼠肿瘤完全消退并长期生存。治愈小鼠3个月后人为处死，原肿瘤部位组织切片经光镜、电镜检查均未见肿瘤细胞，其疗效明显优于其他各组。

钟之海等^［1］报道肺癌小鼠冷冻后再注射短小棒状杆菌菌苗，不仅能延长存活期，还可控制肺和淋巴转移。谢大业等^［2］报道冷冻与厌氧棒状杆菌菌苗联合治疗转移性肺癌，可提高疗效，较单纯化疗组差异有显著性(P＜0.05)。以上均为应用细菌制剂单纯激活非特异性免疫。Hanawa^［3］报道了肝癌小鼠冷冻治疗前注射OK₄₃₂组较其他未加免疫制剂组生存期延长，指出冷冻加术前免疫治疗肝癌小鼠有效。

目前转移癌、复发癌和因身体条件不宜外科手术的肿瘤患者占相当比例，有手术探查指征无法切除的肝癌仍占多数。大肠癌患者初次手术时约有10%～25%已有肝转移，手术后50%出现复发和转移，其中肝转移最常见^［4］。围冷冻手术期联合免疫疗法的抗肿瘤治疗有明显的互补性，对常规难以治愈的非免疫原性肿瘤具有显著疗效。该疗法对肿瘤患者的治疗，尤其对不适宜手术和放疗，也不能承受化疗的患者，提供了一条新的治疗途径。

本课题受中国医学科学院中国协和医科大学院校基金资助(编号 95204)

参考文献

1章崧英主编.实用低温医学.第1版.北京：科学出版社，1994.52.

2谢大业.转移性肺癌的冷冻免疫治疗.肿瘤，1984，4:160-162.

3Hanawa S. An experimental study on the induction of anti-tumor immunological activity after cryosurgery for liver carcinoma, and the effect of concominant innunotherapy with OK₄₃₂. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 1993,94:57-65.

4汤钊猷主编.现代肿瘤学.第1版.上海：上海医科大学出版社，1993.570，536.

(收稿：1998-12-07修回：1999-02-23)