关键词： 肺肿瘤；A549和A549DDP细胞；细胞凋亡；反义寡核苷酸；药物耐受性；基因表达

【摘要】目的探讨顺铂耐药肺腺癌细胞系A₅₄₉^DDP的耐药、凋亡相关基因的表达及其与亲代细胞A₅₄₉的差异，观察差异表达基因的反义寡核苷酸的逆转作用。方法将人工合成的反义、正义硫代脱氧寡核苷酸(S-oligodleoxynucleotide,S-ODN)经脂质体包裹后转染A₅₄₉^DDP细胞，应用RT-PCR检测耐药及凋亡相关基因mRNA水平，免疫细胞化学及流式细胞-抗体(FCM-Ig)检测相应蛋白及核增殖抗原Ki-67表达，MTT检测其耐药性改变，TUNEL、DNA电泳检测细胞凋亡。结果A₅₄₉^DDP细胞多药耐药基因(MDR1)、拓朴异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)、c-myc mRNA及蛋白表达水平接近A₅₄₉，二者c-erbB-2均阴性。A₅₄₉^DDPbcl-2阳性，且MRP mRNA及蛋白水平较A₅₄₉高。bcl-2、MRP反义S-ODN可相应地抑制bcl-2、MRP、c-myc表达，降低A₅₄₉^DDP耐药性，抑制其生长与增殖，促进细胞凋亡。结论肺腺癌A₅₄₉细胞获得顺铂抗药性，与bcl-2和MRP基因高表达有密切关系。

Expression and reversion of drug resistance-and apoptosis-related genes of a DDP-resistant lung adenocarcionma cell line A₅₄₉^DDP

WANG Jie, LIU Xuyi, WU Meina, et al. Department of Internal Medicine, School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing 100036

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of drug resistance-and apoptosis-related genes of A₅₄₉^DDP cells as compared to the parental cell line A₅₄₉, and its reversion by antisense s-oligodeoxynucleotide (S-ODN) of the differentially expressed genes.MethodsSense and antisense S-ODN were transferred into A₅₄₉^DDP cells by lipofectin. Expression of genes related to drug resistance and apoptosis was examined by RT-PCR, immunocytochemitry and flow cytometry. Apoptosis was identified by DNA electrophoresis and TUNEL, and cell growth by MTT uptake.ResultsThe expression of bcl-2 was positive and that of MRP at mRNA and protein levels was increased in A₅₄₉^DDP cells compared to A₅₄₉ cells. MDR1, c-myc and TOPOⅡ were similarly expressed in the two cell lines. Both cell lines were negative for c-erbB-2 expression. In A₅₄₉^DDP cells, the expression of bcl-2 and MRP was significantly inhibited by respective antisense S-ODN. Antisense S-ODN could also significantly inhibit proliferation of A₅₄₉^DDP cells, and promote cell apoptosis by reducing its resistance to cisplatin.ConclusionBcl-2 and MRP genes are responsible for the induced resistance of A₅₄₉^DDP cells to cisplatin.

【Subject words】Lung neoplasmsA₅₄₉and A₅₄₉^DDP cellApoptosisAntisense oligonucleotideDrug resistanceGene expression

非小细胞肺癌耐药机制系多因素参与。除与多药耐药基因/P-糖蛋白（multidrug resistance1/P-glycoprotein,MDR1/P-gp）、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、肺耐药蛋白(lung resistance protein，LRP)、谷胱苷肽/谷胱苷肽-S转移酶（GSH/GST_S)、拓朴异构酶Ⅱ(topoiso-merase Ⅱ，TOPO Ⅱ)等有关，亦涉及细胞凋亡受抑及其相关基因表达^［1，2］。我们在建立肺腺癌耐药细胞A₅₄₉^DDP 基础上，探讨其与亲代细胞A₅₄₉间生物学行为及多种耐药、凋亡相关基因表达的异同，并将差异基因mRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸(S-oligodeoxynucleotide, S-ODN)转染A₅₄₉^DDP 细胞，观察其增殖、凋亡、耐药性以及相应的耐药及凋亡相关基因的改变。

材料与方法

1.反义S-ODN及引物：由赛百盛公司合成。其中bcl-2反义S-ODN针对mRNA翻译起始部位^［3］，MRP反义S-ODN针对mRNA编码区域^［4］。其序列：bcl-2 ：反义S-ODN：5′-CAGCGTGCGCCATCCTTCCC-3′，正义S-ODN：5′-GGGAAGGATGGCGCACGCTG-3′；MRP ：反义S-ODN：5′-TGCTGTTCGTGCCCCGCGCG-3′，正 义S-ODN：5′-ACGACAAGCACGGGGCGCGC-3′；靶基因引物分别为：MRP：5′-TCTCTCCCGACAT-GACCGAGG-3′，5′-CCAGGAATATGCCCCGACTTC-3′ ，其扩增产物为291 bp；MDR1：5′-CCCATCATTGC-AATAGCAGG-3′，5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTAG-3′，其扩增产物为1 671 bp；TOPOⅡ：5′-CTTGTACTGCAG-ACCCACA-3′，5′-ATAATAGAATCAAGGGAATTCCC-AAACTCGA-3′，其扩增产物为233 bp；bcl-2：5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′，5′-CCGCTAG-CTGGGGCCGTACAGTTCC-3′，其扩增产物为318 bp；C-myc：5′-ATTCTCTGCTCTCCTGGAC-3′，5′-TCCAGA-CTCTGACCTTTGCC-3′，其扩增产物为180 bp；C-erbB-2：5′-CCCACGTCCGTAGAAAGGTA-3′，5′-TGAACAA-TACCACCCCTGTC-3′，其扩增产物为240 bp；以β-actin为内参，其引物序列：5′-AGCATCCTAG-AACTCTGTGC-3′，5′-ATTTCGGACCCCTGAACATA-3′，扩增产物400 bp。

2.细胞培养：A₅₄₉^DDP细胞系为我室自建。以耐顺铂（cisplatin, CDDP）16.5倍的细胞为靶，复苏后以含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养，每2～3天传代1次，初始密度1×10⁵/ml。取对数生长期细胞进行试验。

3.免疫细胞化学与FCM-Ig检测：bcl-2、c-myc、 c-erbB-2、C129、Ki-67单抗(工作稀释度1∶20)及异硫氰酸胍标记二抗(FITC-Ig，1∶50)为Santa cruz公司产品，MRP单抗为我室构建纯化(1∶50)。 SP免疫组化。FCM-抗体检测^［3］。

4.RT-PCR：分别收集亲代及耐药细胞5×10⁶/ml，利用Trzol^TM试剂盒提取RNA。测吸光度（A，曾称光密度OD）定量并电泳。逆转录（RT）反应体系25 μl，其中含1.5 μg RNA模板，1×逆转录缓冲液，2.5 μmol/L 随机引物，1.5 U rRNasin ，1 mmol/L dNTP，15 U逆转录酶，42℃1小时后，75℃10分钟。产物行PCR扩增。以β-actin cDNA为内参照。反应体系25 μl：RT产物5 μl，1×buffer，15 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L各引物，1 U Taq酶。94℃预变性3分钟，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35～40次循环。最后72℃充分延伸5分钟。取8 μl PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳。扩增产物辉度扫描，靶基因A值/β-actin A值即为靶基因mRNA的相对量。

5.脂质体介导转染反义S-ODN：取对数生长期细胞以每孔5×10⁵铺入24孔培养板，培养24小时，使之60%融合。脂质体（Gibco BRL）包裹S-ODN按说明书方法进行，其终浓度10 μg/ml，S-ODN终浓度5 μg/mL。细胞分7组：正义bcl-2、反义bcl-2、正义MRP、反义MRP、正义bcl-2+MRP、反义bcl-2+MRP、空白对照组（以消毒三蒸水代替S-ODN）。每组20孔。转染S-ODN后继续培养24小时，收集细胞，部分做RT-PCR，部分行后续试验。

6.MTT试验：将上述各组转染细胞以1×10⁴/孔分别铺入96孔板，每孔加200 μl培养基，12小时后换液并加入终浓度0，20，40，80，100，200 μmol/L的CDDP，重复3次。按常规方法进行MTT检测。根据半数抑制浓度(IC₅₀)值，获耐药倍数。以此方法同时检测A₅₄₉、小细胞肺癌(SCLC)细胞的耐药性。

7.细胞凋亡检测：(1) DNA“梯”电泳：取上述已转染的各组细胞，以0.5×10⁶种入25 ml培养瓶，CDDP作用浓度同前，分别作用12，24，48小时，提取DNA^［5］，1.5％琼脂糖凝胶，60 V电泳。(2)TUNEL原位检测凋亡细胞：取各CDDP作用组细胞（浓度1×10⁵/ml）制片，利用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞。计数10个高倍视野中凋亡细胞的百分比及与Ki-67核增殖细胞的比率。

8.统计学分析：t检验。

结果

1.A₅₄₉/A₅₄₉^DDP细胞耐药及凋亡相关基因表达：亲代细胞A₅₄₉表达MDR1、MRP、c-myc、TOPOⅡ mRNA（A比值分别为0.32±0.05、0.54±0.01、0.38±0.11、0.41±0.07）及其相关蛋白，c-erbB-2、bcl- 2 mRNA阴性（图1）；A₅₄₉^DDP细胞MDR1、c-myc、 tOPOⅡ mRNA水平接近A₅₄₉（分别为0.30±0.09、0.39±0.03、0.33±0.06），但MRP mRNA表达增高（0.81±0.01，P＜0.05)，并出现bcl-2 mRNA表达（图2，mRNA相对量0.41±0.02），c-erbB-2 mRNA及蛋白仍阴性。

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