逆转录病毒载体是向真核细胞中进行基因转移的高效载体之一，是比较成熟和应用范围最广的基因转移和基因治疗载体。胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminese, CD)基因是一重要的自杀性基因，我们研究的目的是克隆构建含有CD基因的重组逆转录病毒载体，并将该基因导入PA317包装细胞，建立完整的和安全高效的逆转录病毒表达载体系统，为开展CD基因与前体药物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5-Fc)联合用于肿瘤的实验治疗研究奠定基础。

材料与方法

1.主要试剂：限制性内切酶、T₄ DNA连接酶购自华美生物工程公司，Lipofectin reagent、G418购自Gibco公司，pLXSN为逆转录病毒载体，pBS.CD为携带CD基因的质粒。E.coli DH5α、PA317及NIH3T3细胞株均为本室保存。

2.重组逆转录病毒载体pLCDSN的构建：用EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ双酶切质粒pBS.CD及逆转录病毒载体pLXSN，获得1.5 kb左右的CD基因和5.8 kb左右的线性载体DNA，经回收、纯化、连接，转化至E.coli DH5α中，筛选出阳性转化子，碱裂法抽提质粒。

3.基因转染及病毒滴度测定：pLCDSN经脂质体法转染PA317细胞，经G418 1 mg/ml筛选获得阳性细胞克隆，并扩大培养。收集重组病毒上清液，以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度。

4.neo^r基因检测：上游引物：5′-ACA ATC GGC TGC TCT GAT-3′，下游引物：5′-CTC GCT CGA TGC GAT GTT-3′；以细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

5.辅助病毒的检查：应用重组逆转录病毒转导NIH3T3细胞和肝癌SMMC7721细胞，经G418 1 mg/ml筛选后收集培养液。应用此培养液，加入polybrene 8 μg/ml，分别感染5×10⁵ NIH3T3细胞和SMMC 7721细胞3小时，置换新鲜培养基，培养24小时后，消化传代，加入G418 1 mg/ml，筛选7天，观察有无抗性克隆产生。

结果

1.逆转录病毒载体的构建：重组质粒pLCDSN经Hind Ⅲ单酶切，切出了7.34 kb的线性DNA片段；用Kpn Ⅰ单酶切，切出了3.1 kb和4.24 kb两个DNA片段；用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，切出了1.52 kb的目的基因片段和5.82 kb的DNA片段。上述结果证明，CD基因已克隆至载体pLXSN中，将重组载体命名为pLCDSN。

2.基因转染PA317细胞：细胞经基因转染后，经G418 1 mg/ml筛选培养，2～3天细胞开始死亡；7～8天大部分细胞死亡，并开始有新的细胞克隆出现；继续用G418筛选2周后，挑选抗性克隆进行扩大培养。将pLXSN空载体转染的抗性细胞克隆命名为PA/LX，pLCDSN转染的抗性细胞克隆命名为PA/CD。

3.neo^r基因扩增：经neo^r基因的PCR分析，在pLCDSN转染的PA/CD细胞中扩增出了预期的430 bp大小的DNA片段，而在未转染的PA317细胞中则不能扩增出相应大小的DNA片段。表明重组逆转录病毒载体pLCDSN对PA317细胞的基因转移是成功的。

4.重组逆转录病毒滴度的测定：所制备的重组逆转录病毒的滴度约(4.6×10⁵～3.4×10⁶) CFU/ml，表明pLCDSN在转染PA317细胞以后产生了较高滴度的重组病毒。

5.辅助病毒的检测：重组逆转录病毒感染NIH3T3和SMMC7721细胞后，应用NIH3T3细胞和SMMC7721细胞的培养液再次感染NIH3T3细胞，不再出现抗性细胞克隆。表明重组逆转录病毒只有一次性的感染能力，没有辅助病毒的产生。

讨论

CD基因作为一种自杀性基因，将其导入肿瘤细胞后，可使无毒的前体药物5-Fc转化为抗癌药物5-Fu，达到杀伤肿瘤细胞的作用。我们将CD基因组入逆转录病毒载体pLXSN，构建成重组逆转录病毒载体pLCDSN，经脂质体法导入PA317包装细胞，neo^r基因的PCR分析表明，外源基因已整合入包装细胞的基因组中。本实验构建的重组逆转录病毒载体pLCDSN，可使CD基因受控于具有很强启动作用的病毒LTR启动子，经PA317细胞包装后，得到了较高的重组病毒滴度。在逆转录病毒表达载体用于基因治疗的过程中，安全性是受到关注的重要问题之一。载体pLXSN及包装细胞PA317具有较好的安全性。1989年开展的TIL/N2基因转移及1990年首例ADA基因治疗的临床试验均使用PA317包装细胞。Anderson报道，从灵长类动物的实验表明，辅助病毒导致肿瘤需要两个条件：高剂量的辅助病毒和动物严重的免疫抑制，少量的辅助病毒导致肿瘤的可能性非常低。实验表明，重组逆转录病毒pLCDSN是安全可靠的。pLCDSN可望作为一种安全高效的CD基因转移和表达载体用于肿瘤基因治疗的实验研究和临床实践中。

(收稿：1998-04-03修回：1999-03-15)