关键词： β-榄香烯；癌症瘤苗；热休克蛋白类

【摘要】目的探索中药莪术有效成分β-榄香烯的抗肿瘤作用及其分子机理。方法用免疫荧光法和流式细胞仪检测不同因素处理的小鼠肝癌H22细胞膜HSP70蛋白表达的变化，并用处理后的H22细胞作为抗原进行体内抗肿瘤免疫保护实验。结果各实验组H22细胞胞膜HSP70蛋白的表达率及表达强度均较对照组细胞有显著增加（P＜0.001）。表达率以β-榄香烯和丝裂霉素处理组细胞为最高，达95.1%，而热休克能进一步增加胞膜HSP70蛋白的表达强度。用β-榄香烯处理的H22细胞免疫C57BL/6小鼠能诱导出特异性抗肿瘤免疫，该作用可部分被抗HSP70分子的单抗阻断。肿瘤发生率在β-榄香烯诱导组、单抗阻断组及阴性对照组小鼠中分别为27.3%(3/11)、50.0%(5/10)、100.0%(10/10)。攻击后第28天小鼠平均瘤重分别为(0.17±0.33) g、(0.66±0.77) g和(1.11±0.58) g。结论β-榄香烯等处理的H22细胞具有较强免疫原性，能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫，是一种良好的肿瘤疫苗。其抗肿瘤效应是或部分是由表达在肿瘤细胞膜上的HSP70蛋白所介导。

Preliminary study on the antitumor immuno-protective mechanism of β-elemene

WU Weizhong, LIU Kangda, TANG Xiaolei , et al. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

【Abstract】ObjectiveTo study the antitumor effects and their molecular mechanism of β-elemene, which is one of the effective monomers of Oleum Curcuma aromatica, a Chinese anticancer medicament.MethodsThe expression of membrane protein HSP70 on H22 cells treated with β-elemene or mitomycin C(MMC) was analysed by immunofluorescence and flow cytometric techniques and the antitumor effects of the treated H22 cells was examined in C57BL/6 mice.ResultsThe expression rate or intensity of membrane protein HSP70 of H22 cells treated with β-elemene, and those treated with MMC was both significantly higher than that of the untreated H22 cells (P＜0.001). Increase in HSP70 expression was most marked when H22 cells were treated with β-elemene and MMC in combination, with an expression rate of 95.1%. Heat shock treatment of the H22 cells combined with other stress-inducing factors could further increase the HSP70 expression intensity. Specific antitumor immunty could be elicited in C57BL/6 mice immunized with β-elemene-treated H22 cells, and the effect could be partially blocked by anti-HSP70 mAb. In mice immunized with β-elemene-treated H22 cells, tumor developed in 3 of 11 mice, while in the immunized mice given anti-HSP70 mAb, 5 out of 10 mice developed tumor, and all of the control mice developed tumor. The average tumor weight (g) on day 28 after challenge with untreated H22 cells was 0.17±0.33, 0.66±0.77 and 1.11±0.58 in the three groups of mice, respectively.Conclusionβ-elemene increases tumor cell immunogenecity by inducing, at least in part, elevated expression of heat shock protein 70 on tumor cell surface.

【Subject words】β-elemeneCancer vaccineHeat shock proteins

70年代初人们发现，用抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞去免疫动物，能使其获得特异性的抗肿瘤免疫。丝裂霉素C（MMC）是目前临床上常用的一种抗肿瘤药物，而β-榄香烯是我国新近批准生产的抗肿瘤新药，是中药莪术的主要成分之一。二者均为良好的抗肿瘤药物，不仅能直接作用于肿瘤细胞核中的DNA，起抑制或杀伤肿瘤的作用，而且能提高肿瘤细胞的免疫原性，增强机体对其的杀伤活性^［1，2］，但对后者所涉及的分子基础目前尚不清楚。有文献报道^［3，4］，HSP70蛋白可携带多种抗原多肽，起到抗原提呈分子的作用。而多种刺激因素，包括化疗药物，能诱导和改变肿瘤细胞浆内及胞膜HSP70蛋白的合成及分布^［5］。因此，本实验旨在观察β-榄香烯等药物单独或联合热休克处理的H22细胞，其胞膜HSP70蛋白表达的变化以及药物处理后的H22细胞免疫C57BL/6小鼠抗肿瘤的保护效应，为进一步阐明抗肿瘤药物，尤其是β-榄香烯处理肿瘤细胞后提高免疫原性的机理及新型瘤苗的研制提供理论依据。

材料与方法

一、材料

4～6周龄C57BL/6小鼠31只，雌16只，雄15只，购自上海医科大学实验动物中心 。小鼠肝癌细胞株H22细胞在上海医科大学免疫教研组传代，RPMI 1640完全培养液为Sigma公司产品，抗小鼠HSP70 IgG2a单抗为Santa Cruz Bio-Tech公司产品，兔抗鼠IgG FITC 标记多抗为中国科学院上海实生公司产品，β-榄香烯为大连金港制药有限公司产品，丝裂霉素C为上海新亚药业有限公司产品。

二、方法

1.H22细胞的制备：体外培养的H22细胞经腹腔接种于4～6周龄的C57BL/6小鼠，12～16天后取腹水中H22细胞（如遇血性腹水，就用比重为1.088的ficoll分离液现配成双层不连续梯度分离液，其中上层为75％，下层为100％，经离心除去红细胞），离心洗涤后，用RPMI 1640 完全培养液调节细胞浓度供以下实验用。

2.实验分组及HSP70蛋白的检测：(1)单因素处理组：1.0×10⁶/ml H22细胞置于1.5 ml的eppendorf管中，分别用β-榄香烯（100 μg/ml）、MMC（100 μg/ml）或43℃热休克处理2小时。(2)多因素处理组：H22细胞用两种或两种以上的因素同时处理。具体分为4组：β-榄香烯与热休克、MMC与热休克、β-榄香烯与MMC、β-榄香烯和MMC与热休克。其中复合处理组中使用的药物浓度及热休克温度均同单因素处理组。收集处理组H22细胞，用RPMI 1640培养液离心洗涤后，在37℃、5％CO₂孵箱中恢复2小时。加抗小鼠HSP70单抗2 μl/管，室温孵育1小时，离心弃上清，加荧光二抗12 μl/管，室温孵育1小时后，PBS洗涤2次，流式细胞仪（FCM）检测胞膜蛋白表达的改变 （中国科学院上海细胞生物研究所FCM室）。实验同时设阴性及非特异性荧光二抗对照组。

3.肿瘤免疫保护试验：将C57BL/6小鼠随机分为3组。第一组为β-榄香烯和MMC联合处理免疫组（11只小鼠）：H22细胞用浓度均为100 μg/ml的β-榄香烯及MMC联合处理2小时，离心洗涤3次后，置37℃恢复培养2小时，调细胞浓度至5×10⁶个/ml，经腹腔免疫C57BL/6小鼠，0.2 ml/只，第7 天再加强免疫1次，共2次。第二组为HSP70单抗阻断免疫组（10只小鼠）：收集第一组处理及恢复培养后的H22细胞，在体外加抗小鼠HSP70特异性单抗6 μl/管，室温孵育1小时，离心洗涤后免疫C57BL/6小鼠。第三组为RPMI 1640对照组（10只小鼠）。第14天用细胞浓度为1×10⁷/ml体外培养的H22细胞攻击C57BL/6小鼠左腋皮下，剂量为0.1 ml/鼠。观察小鼠的肿瘤发生率及肿瘤生长速率。

结果

1.各因素处理H22细胞前后HSP70表达的变化：本研究各应激因素（包括单因素及多因素）均能诱导H22细胞表达一定量的胞膜HSP70蛋白。其中H22细胞经43℃热休克2小时、MMC 及β-榄香烯单因素处理后,胞膜HSP70蛋白表达率分别为10.1%、36.5％和69.2%；经β-榄香烯与热休克、MMC与热休克、β-榄香烯与MMC及β-榄香烯、MMC与热休克多因素处理后，蛋白表达率分别为71.2％、72.3%、95.1%和85.3%。故不论是单因素还是多因素处理的H22细胞，其胞膜HSP70蛋白的表达率均明显高于未处理的H22细胞（5.9%）及非特异性荧光对照组细胞（3.4%，P＜0.001）。

多因素处理的细胞，其胞膜HSP70蛋白的阳性表达率均较单因素处理后要高。如MMC与热休克复合处理后，HSP70蛋白的表达率几乎是MMC单独处理后的2倍。β-榄香烯与MMC联合处理的H22细胞，其胞膜HSP70蛋白的表达率为最高，达到95.1%，约为各单因素处理后的结果之和。

热休克能进一步增加处理细胞的蛋白表达强度。尽管热休克、β-榄香烯、MMC三者联合处理的H22细胞，其HSP70蛋白表达率要低于β-榄香烯与MMC药物联合处理组细胞，但HSP70蛋白表达强度较后者增强近10倍。

2.体内免疫对同种野生型肿瘤的抵抗效果：用体外培养的野生型H22分别攻击不同免疫组C57BL/6小鼠。结果为：第一组小鼠肿瘤发生率为27.3%(3/11)，皮下瘤块最早可触及时间为攻击后第13天；第二组小鼠肿瘤发生率为50.0%(5/10)，皮下瘤块最早可触及时间为攻击后第9天；第三组小鼠肿瘤发生率为100％(10/10)，最早可触及肿瘤时间为攻击后第9天。H22细胞攻击小鼠后第28天处死小鼠，测上述3组小鼠肿瘤的平均重量分别为(0.17±0.33) g、(0.66 ±0.77) g和(1.11±0.58) g (图1)。小鼠肿瘤发生率曲线及肿瘤生长曲线如图2,3所示。

A：RPMI 1640免疫组；B：HSP70单抗阻断免疫组；

C：β-榄香烯诱导免疫组

1野生型H22细胞复攻击不同免疫组C57BL/6小鼠后第28天