关键词： 肿瘤转移抑制基因；序列分析；人基因组DNA；基因转染；聚合酶链反应

【摘要】目的分离鉴定人类肿瘤转移抑制基因或相应DNA序列, 探讨转移表型逆转的分子生物学机制。方法应用Inter Alu PCR技术，将导入正常人肺基因组DNA片段后转移表型抑制细胞株中的人源性DNA片段扩增出来,对其中的700 bp左右DNA片段进行核苷酸序列分析，并在GenBank序列数据库进行类似性检索。将该DNA再次转染高转移小鼠瘤细胞株，通过体内、体外转移相关性实验，验证其是否具有抑制高转移小鼠肺癌细胞转移的能力。结果同源性比较显示，上述700 bp人DNA片段为未知人基因组DNA序列,已被GenBank收入数据库（pt712 U67835）。将该DNA再次导入高转移小鼠瘤细胞后，体内、体外转移相关性实验均表明，该转染细胞对高转移小鼠肺腺癌细胞转移表型具有一定的抑制作用。结论从转移表型逆转小鼠细胞中分离出的700bp人基因组DNA序列,具有使肿瘤细胞转移表型发生逆转的重要作用。

A novel human DNA sequence with tumor metastasis suppressive activity

GE Xueming, LU Yinglin, FU Shengfa, et al.

Institute of Basic Mediccal Sciences, Beijing 100850

【Abstract】ObjectiveTo isolate human tumor metastasis suppressive DNA sequence and to study the molecular mechanisms regulating tumor metastasis.MethodsA mouse lung adenocarcinoma cell clone 12 derived from its parent cell line LM2, which had been transduced with normal human genomic DNA, was previously reported. Compared with LM2, the metastatic potential of clone 12 was very much decreased. Clone 12 was used in this study to amplify the human DNA fragments by Inter Alu PCR technique. The human DNA fragments obtained were then transfected into LM2 cells and their malignant phenotype was observed in vitro and in vivo, and compared with that of the untransfected LM2 cells.ResultsThree human DNA fragments of 700, 500 and 300 bp were isolated. DNA sequencing revealed that the 700 bp fragment does not show homology with hitherto reported genes and was accepted by the GenBank (pt 712 U67835). In vitro proliferation and colony formation in soft agar of the 700 bp fragment-transfected LM2 cells were significantly inhibited as compared to the untransfected LM2 cells. Upon subcutaneous inoculation to syngeneic T739 mice, the 700 bp-transfected LM2 cells grew more slowly and smaller tumors developed compared to the un-transfected ones. Moreover, lung metastasis was not found in 6 of 10 mice inoculated with the 700 bp-transfected LM2 cells, while it was found in 9 of 10 mice inoculated with the un-transfected LM2 cells. The difference was statistically significant (P＜0.001). The frequency of lymph node metastasis was also statistically different between the 2 groups of mice.ConclusionThe newly isolated 700 bp human DNA fragment may be a metastasis suppressor gene of malignant tumor.

【Subject words】Neoplasm metastatic suppressor geneHuman genomic DNAGene transfectionSequence analysisPolymerase chain reaction

克隆鉴定肿瘤转移抑制基因是近年来肿瘤转移分子机制中的一个研究热点。 目前认为，凡能够以某种方式或作用途径抑制肿瘤转移形成的基因，均可命名为转移抑制基因。为寻找人类新的肿瘤转移抑制基因, 我们应用表型克隆^［1,2］新概念，采用培养细胞负选择法^［3］，将人正常基因组DNA导入高转移小鼠肺癌细胞株后，获得了转移表型回复突变小鼠细胞株^［4］。 为进一步克隆分析引发此转移表型逆转的相关基因或DNA序列, 我们应用Inter Alu PCR技术，扩增该小鼠转移表型抑制株中的人源DNA片段，并对其进行了核苷酸序列分析。再将该DNA转导原高转移小鼠瘤细胞株中，以验证其与小鼠肺癌细胞的转移相关性。

材料与方法

1.质粒、细胞株及实验动物：PSV2neo： 真核表达载体，本室保存。LM2细胞株：本室建立的高转移克隆化小鼠肺腺癌细胞株^［4］，体外培养呈圆形或短梭形，贴壁生长，接种裸鼠皮下可发生肺、淋巴结自发性转移，转移率达90%以上。12号转移表型回复突变株：经人正常基因组DNA片段导入、G418及Ouabain双重筛选的转移表型比其母系LM2株大为降低的小鼠克隆化肺腺癌细胞株^［4］。T739小鼠： 引自中国医学科学院肿瘤研究所, 雌性，鼠龄5～7周，体重20～25 g。

2.转染人源性DNA转移表型回复突变小鼠细胞中人源性DNA的分离纯化:采用Inter Alu PCR技术^［5,6］。

PCR引物：本室自行设计的人特异3′Alu引物:5′CCGAATTCAGAGCGAGACTCCGTCTC3′, 该引物经“Goldkey”软件查询与啮齿类无同源性。模板DNA的制备:采用溶胞法^［7］进行。Alu片断区间PCR反应条件:预变性98℃ 300秒, 变性94℃ 60秒, 退火55℃ 30秒, 延伸72℃ 100秒, 循环35次。使用本院研制的PTC-51B DNA扩增仪。Inter Alu PCR产物的分离纯化:1.5%琼脂糖凝胶电泳分离, Wizard^TWPCR纯化试剂盒（美国Promega公司）回收。

3.人源性DNA片段重组构建、序列分析与同源性比较: 将人源性DNA片段与pGEM-T载体（美国Promega公司）体外重组后, 以美国Applied biosystems 373型DNA测序仪测序, 该序列通过Internet网络与Genbank数据库中的DNA序列进行同源性比较。

4.细胞转染：细胞转染按照美国Promega公司 Lipofectamine转染试剂盒方法进行。

5.细胞总RNA与人源性DNA片段狭缝杂交：提取细胞总RNA，被测RNA样品用点膜器点尼龙膜；探针标记与杂交按军事医学科学院(长臂)光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒说明书操作。

6.细胞体外增殖速度测定及软琼脂细胞集落形成实验：参见文献［8,9］。

7.小鼠体内成瘤与自发性转移实验：将随机分组的T739小鼠(每组10只)，按1×10⁶/0.2ml细胞数接种于每只小鼠颈背部皮下。每隔2天观察结节成长情况，测量并记录肿瘤结节的长度(L)和宽度(W)，其肿瘤体积(mm³)=(L×W²)/2。待肿瘤直径＞2 cm或荷瘤小鼠十分孱弱时处死、解剖，常规取材，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下阅片。

结果

1.12号转移表型回复突变株中人源性DNA片段（h700DNA）的克隆分析：提取12号转移表型回复突变细胞株的基因组DNA作为模板, 采用Inter Alu PCR技术^［5］对其进行PCR扩增，获得了700,500,300 bp的3条人源性DNA片段。我们将其中的700 bp人源性DNA片段（h700DNA）重组构建后进行核苷酸序列分析, 并与GenBank序列数据库进行序列类似性检索, 未发现与之同源的基因序列, 现已被GenBank作为人类新基因组DNA片段录入, 登录号为pt712 U67835。人源性DNA片段部分序列结果如下:

ATCTGCACTCCAGCCTGGGGTATATGAGATCAAGCTGGGA

CTTAGTCTTCGCATAACTGGATGCTCATGACTATACATTA

TGTATAGGACGTGATATGGATATGGCCTTAATATTAATGA

TTTTCCCCCTAGAGAAGAGAAATAAAATTTTTGAAAGTTT

AAGTGATAGAGCAATATTTGTAGTCATGAATTCTTACTTC

TTTCCTTCTGCTTGTCTTGTGGTTGGATATTGCATGGGTG

GTCCTGATGTTGGCTTCTAATTTGAGTTTATGCTTAAGAG

TTCCAGAAGATCAATGTCTGGAAAATTGGTATCTACCTAT

CTGTTTGTCTACTGGTGAAAGCAAAGGGTATTTTAGCTGT

ATCTGTCTCACTGCTCGTTTTTCCTGTATAGTGTGGTGGT

GTGTGTGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAACCATTAATG

CAGTAATCCNCCAATTGGACCTCATGCCCAGGCTGGGAAG

TGCAGAATCCACNAAGGTGCGGGCCGCCTGCAN

2.h700 DNA 片段基因转导高转移小鼠LM2细胞中h700 DNA 片段的表达：h700DNA片段经基因转染导入高转移小鼠肺腺癌LM2后获得一转染细胞(LM2-h700)，将该人源性DNA片段经(长臂)光敏生物素标记后，以此为探针(2 μg)分别与转染h700的转染细胞及对照LM2细胞总RNA(各约10 μg)进行狭缝杂交。结果显示，转染h700DNA的细胞总RNA杂交出现蓝紫色杂交带, 说明该转染细胞中存在人源DNA片段mRNA水平转录表达。

3.h700 DNA 片段基因转导小鼠LM2细胞后细胞形态的变化：未转染LM2细胞体外培养呈短梭形或圆形，立体感及折光性强; 而h700DNA转染细胞体外培养的大多数细胞为扁平镶嵌状，折光性及立体感均减弱，与未转染LM2细胞形态有明显不同。

4.h700 DNA 片段基因转导对小鼠LM2细胞体外增殖的影响：采用直接计数法检测h700DNA转染组及未转染LM2