我们用肿瘤患者胸水间期细胞进行非荧光原位杂交，现将检测结果报告如下。

材料与方法1.标本：人胸水标本，由中国医学科学院肿瘤医院临床细胞室提供。2.探针：pJM 128：含人8号染色体着丝粒特异DNA片段(D8Z2)，ATCC。pHS 53：含人11号染色体着丝粒特异DNA片段(D11Z1)，ATCC。3.胸水原位杂交标本的制备：取临床送检胸水标本，离心后以PBS洗涤沉淀，收获细胞，以常规甲醇：冰乙酸固定法固定，滴片，-20℃冰箱保存，用于原位杂交。4.制备探针：从转化菌中提取质粒DNA，纯化后用Bio-Nick TM labeling system试剂盒(Gibco BRL，USA)标记探针。标记好的探针用变性缓冲液(55% deionized formamide, 1×SSC, 10% dextran sulfate, 1 mg/ml salmon sperm DNA)配成20 μg/ml的杂交液，80℃变性10分钟，立即入冰。5.杂交：-20℃保存已固定好的标本，以70%乙酸和3%H₂O₂的甲醇处理后，于乙醇中系列脱水，吹干。加上述已变性过的DNA探针，封片，置已预热的微波炉中(浙江临安电子器材厂，YWY医用微波仪)，8档作用30分钟，保温30分钟，后置37℃温盒中继续杂交过夜。6.ABC法检测：(1)杂交完成后，分别于44℃ 50%甲酰胺2×SSC和2×SSC洗涤，室温下在0.1% Tween 20的PBS中浸泡。(2)用3%BSA的PBS封闭，微波炉中加入50 ml 14℃水，8档封闭5分钟。(3)依次加上Avidin (1∶100, 3% BSA稀释)生物素化的羊抗卵白素抗体5 μg/ml，3% BSA和新鲜配制的AB复合物(1∶100，3% BSA稀释，用前30分钟混合)，于微波炉中作用5分钟，保温5分钟，0.1% Tween 20的PBS洗涤。(4)DAB显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，光学树脂封片后以光镜观察结果。7.荧光法检测：第(1)(2)步骤同ABC法检测，但杂交前不需3%H₂O₂的甲醇处理。(3)依次加上Avidin-FITC5 μg/ml，4×SSCB (0.5% blocking regent，0.02% NaN₃，4×SSC)，生物素化的羊抗卵白素抗体5 μg/ml，4×SSCB和Avidin-FITC 5 μg/ml，4×SSCB，于微波炉中8档作用5分钟，保温5分钟，0.1% Tween 20的4×SSC洗涤。(4)乙醇梯度脱水，晾干，加PI 0.5 μg/ml防褪色液(90% glycerol, 2% DABCO，0.02% NaN₃，20 mmol/L Tris，CI pH 7.5)，封片后在荧光显微镜下观察结果，用ASA 400彩色负片照相。

结果以11号染色体着丝粒探针进行非荧光原位杂交，结果显示分裂相中存在3条11号染色体，杂交信号位于染色体着丝粒部位，而同一标本中，有71.5%的肿瘤细胞在间期细胞核内显示3个杂交信号。以8号染色体着丝粒探针对同一标本进行荧光法和非荧光法原位杂交，结果显示肿瘤细胞中同样出现8号染色体4倍体。通过9例患者淋巴细胞以两种方法比较，结果很类似。8号染色体着丝粒杂交出一个信号的细胞分别为8.18%(FISH法)和12.31%(ABC法)，两个信号的分别为91.82%(FISH法)和87.09%(ABC法)。此外，ABC法检测的细胞中，没有信号和有3个信号(非特异性杂交)的细胞分别占0.29%和0.31%。FISH法敏感性稍强一些，但与ABC法比较，差异无显著性(P＞0.05)。

讨论常规的染色体分析对象是中期分裂相染色体。但是人体组织的大部分细胞在常规检查中不处于分裂期，中期分裂相仅占细胞周期的十几分之一乃至几十分之一。实体瘤细胞也是如此。若要获得中期染色体，需要经过细胞培养及相应的处理，但实体瘤仍然很难得到足够的中期分裂相。间期核原位杂交检测，使对处于这一时期的细胞进行染色体分析成为可能。间期核原位杂交在检测染色体数目方面也较G带方法准确。其原因为：(1)无染色体识别困难；(2)每个间期核包含了该细胞核的全部染色质成分，避免了制片过程中由于分散的中期染色体丢失或由相邻核染色体并入的可能。本研究采用染色体着丝粒探针(centromere probes)在细胞滴片和组织印片上进行间期核原位杂交。着丝粒探针为α卫星DNA(α-satellite DNA)，属于不含任何基因的高度重复的短序列，重复数百至数千次，位于染色体着丝粒处。用此类探针做间期核原位杂交，目前多用于检测染色体数目异常。

荧光原位杂交技术(FISH)快速，安全，经济，灵敏度高，特异性强，但是要求有昂贵的荧光显微镜，且标本不易保存，使其应用于临床受到了限制。本实验在已建立的荧光原位杂交技术的基础上，经过改进，以ABC法检测原位杂交结果，克服了这一缺点，使原位杂交技术应用于临床有了可能。与荧光法对比，ABC法的敏感性稍差，这是因为显色剂本身与荧光物质发光的特性不同，荧光可使分辨率提高；再者，带有辣根过氧化物酶的生物素和显色DAB为较大的分子，它们对细胞的穿透能力较荧光素为弱。但是ABC法有其优越性：(1)获得的信号可用普通的光学显微镜检测，并且标本保存时间长，可存档，不会随时间的流逝而褪色；(2)可结合细胞形态进行信号分析；(3)适合于分析肿瘤异质性和染色体拷贝数异常与组织学、免疫细胞化学和临床特点的关系。因此作为临床应用，ABC法较荧光法有着更广阔的前景。

(收稿：1997-11-14修回：1997-12-30)