关键词： 喉肿瘤；p53基因；腺病毒；基因治疗

【摘要】目的探索p53基因在喉癌基因治疗方面的可行性。方法以人喉癌细胞系Hep-2为实验对象，将载有人野生型p53 cDNA并含巨细胞病毒(CMV)启动子的重组腺病毒(Ad5CMV-p53)感染Hep-2细胞及肿瘤组织，体内外实验观察Ad5CMV-p53对Hep-2细胞生长的影响。结果当Ad5CMV-p53在100 MOI效靶比时，全部Hep-2细胞得到转染。感染2天后p53蛋白表达达到高峰，Hep-2生长受到明显的抑制。Ad5CMV-p53感染Hep-2细胞在裸鼠中失去致瘤性。瘤内注射Ad5CMV-p53后，荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小。结论Ad5CMV-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的喉癌基因治疗途径。

Adenovirus-mediated p53 gene therapy of human laryngeal cancerWang qi, Han Demin, Wang Wenge, et al. Beijing Institute of Otolaryngology, Beijing 100005

【Abstract】ObjectiveTo explore the potential use of p53 in gene therapy for laryngeal cancer. MethodsA human laryngeal cancer cell line Hep-2 was used. Recombinant cytomegalovirus-promoted adeno-viruses containing human wild-type p53 cDNA was transiently introduced into Hep-2 cells in vitro and injected into tumor nodules in vivo. The growth of Hep-2 cells in vitro and established s.c. squamous carcinoma nodules in nude mice was examined. Results The transduction efficiency of Hep-2 cell line was 100% at ≥100 MOI. The p53 protein expression peaked on day 2 after infection and lasted far 5 days. Cell growth was greatly suppressed. In vivo studies, Ad5CMV-p53 transfestion in vitro inhibited tumorigenicity of Hep-2 cells in nude mice. Intra-tumoral injection of Ad5CMV-p53 significantly inhibited established sc implanted xenograft. Conclusion Transfection of wild-type p53 gene via Ad5CMV-p53 is a potential approach to the therapy of laryngeal cancer.

【Subject words】Laryngeal neoplasmsp53 geneAdenovirusesGene therapy

近几年兴起的肿瘤基因治疗为肿瘤的防治开辟了新的领域。在具有肿瘤基因治疗潜力的相关基因中，抑癌基因p53成为研究的热点。有研究表明，野生型p53基因与调控细胞生长周期、调节细胞转化和诱导细胞程序化死亡(apoptosis)均有密切关系^［1］。一些研究已显示转染野生型p53表达质粒可使p53蛋白过度表达, 由此直接引起细胞凋亡和（或）抑制生长，最近一些体内外实验已初步证明了野生型p53基因在某些肿瘤治疗方面的潜力^［2］。

我们利用复制缺陷型腺病毒为载体，观察野生型p53基因对喉癌细胞系Hep-2在体外和体内生长的影响，探讨野生型p53基因对喉癌的治疗作用。

材料与方法

1.细胞系和细胞培养: 人喉癌细胞系Hep-2由我所肿瘤生物治疗室冻存；293细胞系由人胚胎肾细胞重组部分5型腺病毒基因组组成, 能产生复制缺陷型腺病毒复制所需的E₁蛋白, 由军事医学科学院放射医学研究所提供。细胞培养为改良DMEM培养液加5％灭活小牛血清。

2. 实验动物: BALB/c裸鼠，共16只，鼠龄4～5周, 雌性，体重14～18 g，饲养于无菌塑料透明隔离器内, 动物实验时严格无菌操作。裸鼠购于北京医科大学实验动物室，寄养于军事医学科学院动物室。

3. 重组腺病毒的构建、繁殖及纯化: p53基因表达载体由巨细胞病毒(CMV)启动子,野生型p53基因(cDNA)和SV40多聚腺苷信号组成，是重组型基因转录单位。把p53基因表达载体插入早一区(E₁区)缺失的5型腺病毒载体, 通过基因重组产生出重组腺病毒(Ad5CMV-p53)；对照病毒Ad5CMV-polyA构建方式同Ad5CMV-p53, 但在启动子和 SV40多聚腺苷信号序列之间未插入任何功能基因^［3］。以上两种重组病毒原料由美国Anderson癌症研究中心的张伟伟博士惠赠。

重组病毒原料直接感染293细胞，并在其内繁殖。293细胞培养在改良DMEM培养液中，感染36～40小时后收获细胞，离心，PBS重悬细胞，经3次冻融法裂解细胞。离心去除细胞碎片，经CsCl梯度超速低温离心(35 000 r/min,4℃)，18小时后病毒纯化， 4℃透析，经空斑实验测定滴度后，保存于-80℃。

4.病毒感染滴度及细胞生长率的检测：24孔培养板内培养等量Hep-2细胞到80%汇合，细胞计数，吸出培养液，Ad5CMV-p53分别以1, 10, 100，1 000MOI(空斑形成单位/每个细胞,pfu/cell)效靶比感染单层细胞，并与非感染细胞为对照, 37℃, 5% CO₂孵育90分钟后加新鲜培养液， 第4天时细胞计数, 选择最佳感染滴度。

在24孔培养板内培养等量Hep-2细胞到80%汇合，细胞计数，吸出培养液，Ad5CMV-p53和对照病毒Ad5CMV-polyA均以100MOI分别感染单层细胞，设空白对照。每天计数1次，每次每组计数3孔，到感染后第5天为止, 绘制生长曲线。细胞计数用台酚蓝＋冰醋酸活细胞计数法。

5.免疫组化法检测p53蛋白表达：以12孔培养板培养Hep-2细胞，80%汇合时以100MOI效靶比感染Ad5CMV-p53。培养90分钟后,吸出病毒液继续培养。感染后每24小时检测1次p53蛋白表达，方法如下: 细胞离心涂片，100％乙醇固定；1%H₂O₂温室孵育，正常羊血清封闭; 加p53抗体Do-7(Dako公司),4℃过夜;滴加1∶300生物素标记羊抗鼠IgG，37℃孵育30分钟;滴加1∶300辣根酶标记的链酶卵白素，37℃孵育30分钟, 复染，脱水，封片。

6. Ad5CMV-p53感染细胞致瘤率实验：选用8只裸鼠。Ad5CMV-p53和Ad5CMV-polyA均以50MOI分别感染Hep-2细胞，培养18小时后，感染细胞5×10⁶以PBS配制成0.1 ml悬液，分别于裸鼠右后背（Ad5CMV-p53感染细胞）和左后背（Ad5CMV-polyA感染细胞）皮下注射;空白对照为0.1 ml PBS前背部皮下注射。检查肿瘤结节形成，观察4周。

7. Ad5CMV-p53对荷瘤裸鼠肿瘤的生长抑制作用：选用8只裸鼠，分别于前背部、右后背部和左后背部不同部位皮下注射0.1 ml 含5×10⁶ Hep-2细胞PBS悬液；肿瘤接种6天后，于不同部位肿瘤小结节(或肿瘤接种部位)内分别注射0.1 ml的1×10⁸ pfu的Ad5CMV-p53(右后背部)、Ad5CMV-polyA(前背部)及空白对照液PBS(左后背部) 。每隔2天注射1次，共注射6次, 每次注射前测量肿瘤体积，观察24天。

结果

1.经293细胞繁殖的重组病毒颗粒原液，用ClCs梯度离心纯化后，Ad5CMV-p53和Ad5CMV-PolyA重组病毒集中在1.25～1.35 gm/cm³密度之间形成病毒带。空斑实验测定病毒滴度Ad5CMV-p53为4×10¹² pfu/ml、Ad5CMV-PolyA为2×10¹¹pfu/ml, 表明已达到较高的病毒滴度。以Ad5CMV-p53和Ad5CMV-PolyA感染Hep-2细胞后, 未见空斑形成, 显示重组腺病毒是一种复制缺陷型病毒, 在无E₁蛋白表达的细胞内不能复制, 这是重组病毒作为基因载体的前提。

2.Ad5CMV-p53对Hep-2细胞生长的影响：Ad5CMV-p53对Hep-2细胞的抑制作用与感染浓度有关，与空白对照相比，在10MOI，即10pfu感染一个细胞时，可达半数最大抑制；在100和1 000 MOI时，Hep-2细胞的生长已完全受到抑制(图1)。

感染后第四天

■对照□Ad5CMV-p53

图1Ad5CMV-p53不同滴度对Hep-2细胞的抑制作用

3.Ad5CMV-p53对Hep-2细胞生长抑制的特异性检测：Ad5CMV-PolyA在100MOI的感染滴度下对Hep-2细胞的生长影响与对照(正常生长细胞)相比没有差别，而Ad5CMV-p53在100MOI感染Hep-2细胞时可达到完全的抑制(图2)。这一结果表明，对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的野生型p53cDNA,而不是缺陷腺病毒载体本身。

4.p53基因在Hep-2细胞中的表达：对Ad5CMV-p53感染后1～5天的Hep-2细胞进行了免疫组化检测，结果显示，在100MOI滴度感染后24小时p53蛋白已见表达，48小时可见强阳性表达，持续5～6天后表达渐弱，对照细胞未见表达。

感染后天数

图2Ad5CMV-p53和Ad5CMV-polyA在100 MOI感染滴度时对Hep-2细胞的抑制作用

5.Ad5CMV-p53感染Hep-2细胞的致瘤性：实验中，8只裸鼠中除1只在实验开始后第12天死亡外(经病理解剖和主要脏器形态学检查未能发现与病毒感染有关，但肝脾出现转移灶)，7只裸鼠肿瘤形成结果见表1。我们观察到对照组和Ad5CMV-polyA 感染组Hep-2细胞在接种1周后即可触及肿瘤结节, 随后肿瘤生长较快; 而Ad5CMV-p53感染的Hep-2细胞在接种4周后未见到肿瘤形成, 与对照相比, 肿瘤形成率为0/7, 而Ad5CMV-polyA感染组的肿瘤形成率为6/7, 与对照组（7/7）相比，无统计学差异。