关键词： 结肠肿瘤；杂环胺；DNA加合物；十字花科蔬菜；细胞色素P450

【摘要】目的研究大白菜(brassica chinensis)对结肠致癌物2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑［4,5-b］吡啶(PhIP)致癌的预防作用及机理。方法雄性SD大鼠喂饲基础饲料或掺有大白菜粉(20%)混合饲料10天后，经口摄入PhIP(10 mg/kg)。以³²P-后标记方法分析动物结肠粘膜、心、肺和肝中PhIP-DNA加合物含量，并测定参与PhIP代谢的细胞色素P450(CYP) 1A1和1A2以及谷胱甘肽转硫酶(GST)活性。结果经喂饲含大白菜饲料的大鼠，其结肠、心、肺、肝等器官中，PhIP-DNA加合物含量显著低于喂饲基础饲料的动物(P＜0.01)，抑制率结肠为82.3%、心脏为60.6%、肺为48.4%、肝脏为48.9%。大白菜对参与PhIP解毒的CYP1A1和GST有显著的诱导作用。与对照组比较，喂饲大白菜大鼠的肝CYP1A1活性增加80.6%(P＜0.01)，肝和肺细胞浆GST活性分别增加18.2%和35.6%(P＜0.05)。结论食用大白菜可有效抑制PhIP-DNA加合物形成，其作用机理可能是诱导解毒酶。

Chemoprevention of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］ pyridine-induced carcinogen-DNA adducts by Chinese cabbage in ratsTan wen, Lin Dongxin, Xiao Ying, et al. Cancer Institute（Hospital）, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

【Abstract】ObjectivesTo examine the preventive effect of Chinese cabbage (Brassica chinensis) against colon carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］pyridine (PhIP)-induced phIP-DNA adduct formation in rats and its possible mechanism. MethodsSprague-Dawley rats were maintained for 10 days on lab chow or chow containing 20% (w/w) freeze-dried cabbage powder prior to administration of a single dose of PhIP (10 mg/kg) by oral gavage. Rats were sacrificed at 20 h after PhIP treatment and PhIP-DNA adducts in the colon, heart, lung, and liver were analyzed using³²P-postlabeling technique. Levels of hepatic cytochrome P450 (CYP) 1A1 and 1A2, as indicated by 7-ethoxyresorufin O-deethylase and 7-methoxyresorufin O-demethylase activity, and cytosolic glutathione S-transferases (GST) towards CDNB in the liver, lung and colon mucosa were measured. ResultsRats pre-treated with Chinese cabbage and given a single dose of PhIP had reduced levels of phIP-DNA adducts in the colon, heart, lung and liver, with an inhibition rate of 82.3, 60.6, 48.4 and 48.9%, respectively (P＜0.01). Enzyme assays revealed that both CYP1A1 and 1A2 were induced by cabbage, but the induction was preferential for CYP1A1 over 1A2 (80.6% vs 50.2%). GST activity towards CDNB in the liver and lung, but not colon, was also significantly induced by the cabbage.ConclusionThe results indicate a preventive effect of Chinese cabbage against phIP-initiated carcinogenesis in rats and the mechanism is likely to involve induction of detoxification enzymes.

【Subject words】Colonic neoplasmaHeterocyclic amineDNA adductBrassica vegetableCytochrome P450

结直肠癌发病率在中国城市呈逐年上升趋势，其原因可能与膳食模式改变即动物性食品增多有关。鱼和肉类食物在高温烹调过程中可产生多种致癌性杂环胺，其中相对含量最多的2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑［4,5-b］吡啶(PhIP)可诱发实验动物结肠癌和乳腺癌^［1］。人食用烹调的肉类食品后，尿中可测到PhIP及其代谢产物^［2］，提示人类通过膳食暴露于这种致癌物。动物实验证明，PhIP在体内经细胞色素P450(CYP)和一些酯化酶激活后攻击DNA，形成PhIP-DNA加合物^［3］。最近的研究表明，一些结肠癌患者的结肠中存在PhIP-DNA加合物^［4］，表明PhIP与人类结肠癌发生有密切关系。流行病学研究也支持这种观点，显示多食肉类特别是烹调很熟的肉类是结肠癌的危险因素^［5］。由于人类无法避免经常随膳食摄入PhIP和其他杂环胺，因此，寻找有效的预防方法消除这类致癌物的潜在危害很有必要。

利用天然食物防癌是预防肿瘤的重要途径。天然食物尤其是植物中含有各种生物活性物质，对肿瘤的启动、促进和发展过程都可能有抑制作用。十字花科蔬菜及其成分可影响生物转化酶表达，从而影响致癌物的致癌作用^［6］。大量的流行病学资料显示，食用蔬菜尤其是十字花科蔬菜可降低包括结肠癌在内的多种癌症的危险性^［7］。我们以致癌物-DNA加合物形成为化学致癌启动生物标志物，研究大白菜对大鼠结肠致癌物PhIP致癌性的影响及作用机理。

材料与方法

1.材料和试剂：大白菜(brassica chinensis)为北京市售商品，洗净切碎后经真空冷冻干燥制成粉末。PhIP购自Toronto research chemicals (Ontario,Can-ada)。7-羟基- 3H-吩恶嗪-3-酮(resorufin)、7-甲氧基-3H-吩恶嗪-3-酮(7-methoxyresorufin)、7-乙氧基-3H-吩恶嗪-3-酮(7-ethoxyresorufin)、还原型谷胱甘肽(GSH)和1-氯-2,4-二硝基苯 (CDNB) 购自Sigma公司。NADPH购自Boehringer Mannheim公司。³²P-后标记分析所用材料和试剂参见文献［3］。

2.动物实验：体重(146±15)g的雄性sprague-dawley大鼠(中国医学科学院实验动物研究所提供)随机分为3组，每组5只。A、B两组喂以基础饲料，C组喂以掺入20%大白菜粉的混合饲料。喂养10天后将动物禁食8小时，B组和C组灌胃给予PhIP (溶于pH4.5的55%乙醇/生理盐水，剂量10 mg/kg)，A组按体重给予相应体积的溶剂。处理后20小时取动物心、肝、肺和结肠粘膜，于液氮速冻后，保藏于-80℃备用。

3.微粒体和细胞液制备：肝、肺和结肠粘膜标本于4℃解冻，生理盐水清洗后，在含有1.4 mmol/L β-二巯基乙醇和0.5 mol/L蔗糖的10 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)中制成匀浆，匀浆于9 000×g离心10 min，弃去沉淀物后，于105 000×g再离心45分钟。上清液(细胞浆)和沉淀物(微粒体)保藏于-80℃备用。

4.³²P-后标记测定PhIP-DNA加合物：用酚提取和乙醇沉淀法分离上述组织的DNA。³²P-后标记测定方法在以前描述^［3］的基础上稍加改变如下：DNA样品经微球菌核酸内切酶和脾磷酸二酯酶水解后，用正丁醇提取富集加合物，后者在T4多核苷酸激酶参与下与［γ- ³²P］ATP反应进行［5’-³²P］标记，标记的样品经核酸酶P1处理后，在PEI纤维素板上层析分离。PhIP-DNA加合物含量以A2024型电子放射自显影系统(packard instrument company)测定，以N-羟基-PhIP修饰的小牛胸腺DNA为定性和定量标准。

5.酶活性测定：谷胱甘肽转硫酶(GST)活性以CDNB为底物测定^［8］。肝微粒体7-甲氧基-3H-吩恶嗪-3-酮O-脱甲基酶(MROD)和7-乙氧基-3H-吩恶嗪-3-酮O-脱乙基酶(EROD)活性测定如文献［9］所述。

6.统计分析：用计算机统计软件SigmaStat(jandel scientific, san rafael, CA)对实验结果进行方差分析和t检验。

结果

1.动物体重增长情况： 喂基础饲料或含大白菜的混合饲料10天后，A、B、C 3组动物体重增加值分别为(42±2.8)g、(46±6.2)g和(45±5.0)g，差异无显著性(P＞0.05)，提示在饲料中增加20%大白菜粉喂养10天对大鼠的营养状况无明显影响。

2. PhIP-DNA加合物形成：³²P-后标记分析发现，大鼠经口摄入PhIP后，心、肺、肝和结肠中均有PhIP-DNA加合物形成。形成的加合物模式与用N-OH-PhIP修饰的小牛胸腺DNA的PhIP-DNA加合物模式相同，主要的加合物(1号)是已被鉴定的dG-C8-PhIP^［3］(图1A、1C和1D)。摄入溶剂的对照组动物，组织中不存在任何DNA加合物(图1B)。PhIP-DNA加合物的含量以结肠最高(53.1±8.7加合物/10⁸核苷)，其次是心(41.4±14.9加合物/10⁸核苷)和肺(22.1±5.0加合物/10⁸核苷)，而肝的含量(4.7±3.7加合物/10⁸核苷)则很低(图2)。喂含大白菜饲料10天后摄入PhIP的大鼠，结肠、心和肺中PhIP-DNA加合物含量分别为9.4±5.1加合物/10⁸核苷、16.3±5.8加合物/10⁸核苷和11.4±3.2加合物/10⁸核苷，显著低于对照组动物相应器官的含量(P＜0.01)。肝中DNA加合物也明显减少(2.4±1.7加合物/10⁸核苷)，但因含量接近检测限而变异大，与对照组相比，差异无显著性(图2)。与对照组比较，大白菜对结肠、心、肺、和肝中PhIP-DNA加合物形成的抑制率分别为82.3%、60.6%、48.4%和48.9%。

3.致癌物代谢酶活性水平：为探讨大白菜降低

A：N-羟基-PhIP修饰的PhIP-DNA标准；B：不给PhIP的对照大鼠结肠DNA；C：喂基础饲料10天后给PhIP(10mg/kg)的大鼠结肠DNA；D：喂含20%(W/W)冷冻干燥大白菜粉饲料10天后给PhIP(1