关键词： 脑肿瘤/治疗；神经胶质瘤/治疗；受体，表皮生长因子；cDNA，反义；基因疗法

【摘要】目的研究表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA对C6鼠脑胶质瘤的体内治疗效果。方法将野生型及已转染EGFR反义cDNA的C6鼠胶质瘤细胞接种于鼠脑右侧尾状核(对照组8只，转染组6只)，并对鼠脑内已形成的C6胶质瘤用脂质体包裹的EGFR反义cDNA瘤区原位注射(治疗组9只)。观察各组大鼠的一般情况、生存期、肿瘤病理学和磁共振成像(MRI)动态改变，采用AgNOR计数、TUNEL法检测肿瘤细胞增殖活性及凋亡。结果对照组8只大鼠平均生存期为17.3天,转染组6只及治疗组6只大鼠生存期明显延长，除因病理检查人为处死外,无自然死亡，存活期超过200天。MRI检查对照组大鼠脑内有明显瘤灶，转染组大鼠未形成瘤灶,治疗组大鼠脑内瘤灶治疗后消失，均与病理学检查结果一致。而且治疗组大鼠C6细胞增殖活性降低,大量细胞凋亡, EGFR表达减少。结论EGFR可望成为基因治疗的优选靶基因。

Therapeutic effect of EGFR antisense cDNA on rat C6 gliomas in vivoLiu xuwen, Pu Peiyu, Wang Guangxiu, et al. Department of Neurosurgery, Tianjing Medical University General Hospital, Tianjing 300052

【Abstract】ObjectiveTo study the therapeutic effect of EGFR antisense cDNA on rat C6 glioma in vivo and find out the feasibility of using EGFR gene as a target in gene therapy of gliomas.MethodWild type C6 cells and C6 cells transfected with EGFR antisense cDNA were implanted stereotaxically to the caudate nucleus of right cerebrum of Wistar rats (control and transfected group, 8 and 6 rats respectively), and rats with cerebral tumor foci were treated with EGFR antisense cDNA mediated by Lipofectamine (treated group, 9 rats). The general manifestation, survival time, MRI features, histopathological change, proliferation activity and apoptosis of the gliomas in each group of rats were observed. Results The mean survival time of control animals was 17.3 days. That of the 6 transfected and 6 treated animals was significantly prolonged. Four transfected and 3 treated rats were killed on day 28-90 after implantation for histopathological examination. The surviving time of the 4 remaining rats (1 transfected and 3 treated rats) was over 200 days. MRI demonstrated a distinct cerebral tumor in control rats, but the tumor foci were not found in the transfected rats and disappeared almost completely in the treated rats. The cerebral gliomas of rats after treatment with EGFR antisense cDNA showed decrease in proliferation activity and apoptosis.Conclusion The results of EGFR antisense cDNA in treatment of rat C6 glioma is encouraging. EGFR gene can be used as the target of gene therapy for malignant gliomas.

【Subject words】Brain neoplasms/therapyGliomas/therapyReceptors, epithelial growth factorcDNA, antisenseGene therapy

我们以往的研究结果表明，恶性胶质瘤表皮生长因子受体(EGFR)过表达^［1，2］，用脂质体介导体外转染EGFR反义cDNA于C6鼠胶质瘤细胞,可显著抑制其增殖并诱导凋亡^［3］。为进一步探索以EGFR作为基因治疗恶性胶质瘤优选靶的可行性，我们研究了已转染EGFR反义cDNA的C6细胞接种于鼠脑的致瘤性以及对鼠脑内已形成瘤灶的C6胶质瘤进行EGFR反义cDNA瘤区原位治疗的疗效,观察大鼠的一般情况、生存期、肿瘤体积变化以及肿瘤病理组织学与细胞生物学特征变化。

材料与方法

1.动物模型的建立: C6细胞由美国NIH惠赠，被转染含反义EGFR cDNA3′端552bp(质粒由意Beguinot博士惠赠)的C6细胞(CPR 3细胞)已鉴定其整合及表达^［3］。每只鼠接种15 μl细胞悬液，内含1.5×10⁶细胞。大鼠经麻醉后固定于江湾Ⅰ型脑立体定向头架,在前囟前1.0 mm,矢状缝右旁开3.5 mm处颅骨钻孔,用微量注射器垂直插入硬膜下5～6 mm,将细胞悬液缓慢注入右侧尾状核。

2.实验动物分组及组织标本采集: Wistar大鼠,体重150～200克,分为3组:(1)对照组8只，接种野生型C6细胞。(2)转染组6只,接种CPR3细胞。(3)治疗组9只,接种C6细胞，第7天及第9天成瘤时,在接种点原位注射10 μl脂质体包裹的2 μg EGFR反义cDNA各1次。各组大鼠均在自然死亡或定期处死后将鼠脑肿瘤分为两部分：一部分石蜡包埋，冠状切片,行大体观察及HE染色和EGFR免疫组化染色;另一部分用OCT包埋，冰冻切片，检测细胞AgNOR数及凋亡。

3.MRI成像:采用GE公司1.5T Signa MR机成像，冠状面和矢状面T1W1平扫及增强扫描。

4.EGFR免疫组化染色：AgNOR染色及计数、凋亡检测用TUNEL法，参见文献［1～3］。

结果

一、大鼠一般情况与生存期观察

1.对照组:接种C6细胞1周后，大鼠觅食饮水活动明显减少，体重下降，继而出现进行性左侧偏瘫，并均于2～3周内死亡。8只大鼠平均生存期为17.3±6.5天。

2.转染组:接种CPR3细胞后一般表现均正常，无自然死亡。6只大鼠中，1只于接种后第33天、4只于第90天、1只于第200天处死，进行病理检查。

3.治疗组:最初2～3周内大鼠一般情况类似对照组，处于濒死状态。 9只大鼠中，3只分别于接种第15,16,16天死亡；另6只未死亡的大鼠自第4周起觅食饮水活动逐渐恢复正常,体重增加，其中3只分别于接种后第28,58,84天处死, 3只于第200天处死行病理学检查。

二、MRI影像学及相应病理组织学变化

对3组大鼠定期检查MRI，并于检查后随机取样处死,观察相应病理变化。

1.对照组:接种C6细胞1周后瘤区表现为淡长T1长T2信号,轻度均匀或不均匀强化，中线轻度移位，病灶体积分别为150,160,186.7，192 mm³。2周后瘤灶为长T1长T2信号，均匀强化或环状强化，中线明显移位，其中3只脑室扩大，瘤灶体积为400,720,506,480,570,550 mm³。病理检查可见C6细胞生长活跃,瘤内有囊变、坏死，侧室脉络丛、室管膜下及蛛网膜下腔可见少量肿瘤细胞。

2.转染组:接种CPR3细胞1周及2周后可见右侧脑室和中线偏右皮质表面短T1长T2信号,轻度不均匀强化，瘤灶体积为34.7 mm³和30.8 mm³；脑室扩大,中线无移位。4，12，28周时复查均未见瘤灶，脑室仍扩大。病理检查脑实质内未见肿瘤细胞，侧室脉络丛、室管膜下及蛛网膜下腔可见少量肿瘤细胞及淋巴细胞。

3.治疗组:接种1周及2周时的结果同对照组。接种后4周及8周检查发现原强化瘤灶逐渐缩小，中线轻度左移，脑室扩大。接种12周及28周时复查，瘤灶消失，中线结构无移位，脑室仍扩大(附图)。第12周及200天病理检查脑实质内均未见肿瘤细胞，侧室脉络丛,室管膜下及蛛网膜下腔可见少量非增殖性C6细胞。

三、EGFR免疫组化染色

对照组肿瘤EGFR表达明显(++/++++)。转染组散在于侧室脉络丛、室管膜及蛛网膜下腔的少量肿瘤细胞，EGFR表达不明显(-/+)。治疗组中，3只大鼠于接种后第15～16天死亡，其肿瘤组

A：成瘤后1周B：成瘤后2周C：成瘤后4周D：成瘤后12周

附图治疗组大鼠脑部MRI冠状面扫描影像

织EGFR表达同对照组(+++/++++)；而于接种后第28，58天处死的大鼠肿瘤EGFR表达减弱(为++及+)。

四、肿瘤细胞增殖活性测定

对照组肿瘤细胞AgNOR平均计数为3.94±0.19。转染组仅有少量肿瘤细胞散在于室管膜下及蛛网膜下腔等部位,不能精确计数。治疗组中，3只于接种后第15～16天死亡，其肿瘤组织AgNOR计数分别为3.05,3.91,3.45;而于接种后第28,58天处死者其肿瘤组织AgNOR计数分别为1.45及1.83。

五、细胞凋亡检测

对照组及治疗组中3只治疗无效死亡的大鼠C6肿瘤中偶见凋亡细胞；转染组也可见少量凋亡肿瘤细胞；而治疗组于接种后第28天及58天处死的大鼠C6肿瘤中可见大量凋亡细胞。

讨论

EGFR反义核酸抑瘤作用仅见于人结肠癌、胰腺癌及KB细胞系的体外试验报道^［4，5］。我们在以往体外试验基础上，进一步观察EGFR反义cDNA对C6胶质瘤体内生长的影响。

为在同一动物模型中进行肿瘤生长的动态观察和治疗前后的对比研究,我们采用MRI进行动态监测，其鼠脑及胶质瘤灶可清晰成像，并与病理变化相一致，有利于探讨肿瘤生长规律及反义基因治疗效果。 MRI及病理检查表明，转染反义EGFR的C6细胞在鼠脑内不