关键词： 苦参碱K562细胞细胞周期细胞分化端粒酶

【摘要】目的为寻找新的肿瘤细胞诱导分化剂，探讨了苦参碱对K562细胞的诱导分化作用及其机制。方法采用PCR-Elisa方法检测苦参碱作用前后端粒酶活性的改变，以流示细胞仪分析细胞周期的改变。结果苦参碱作用后的K562细胞，其端粒酶活性明显受抑，且细胞周期明显改变，S期细胞数显著降低。结论苦参碱对K562细胞有诱导分化作用，其机制可能与抑制端粒酶活性、阻止细胞周期的进程有关。

Effects of matrine on telomerase activity and cell cycle in K562 cellZhang Liping, Jiang Jikai, Tan Rongan, et al. Department of Clinical Biochemistry, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400046

【Abstract】ObjectiveIn order to search for new tumor differentiation inducer, the effects of matrine of Chinese herbal origin on differentiation of K562 cells and its mechanism were studied. MethodsTelomerase activity was determined by PCR-ELISA in untreated or treated K562 cells, cell cycle phases were analyzed by fluorescence-activated cell sorter analysis. Results Telomerase activity of K562 cells was significantly inhibited when treated with matrine, and cell cycle of the treated K562 cells was changed with marked decrease in S phase. ConclusionMatrine can induce differentiation of K562 cells, the mechanism of which might be related to the inhibition of telomerase activity and cell cycle arrest.

【Subject words】MatrineK562 cellsCell cycleCell differentiationTelomerase

80年代以来，肿瘤细胞的诱导分化治疗已成为肿瘤治疗的研究热点之一。苦参是我国传统的常用中成药，我们在研究中发现，适当的苦参碱浓度对K562细胞有诱导分化作用，并在光镜、电镜形态和组织化学染色等方面得到证实^［1］。为进一步阐明其诱导分化机制，我们以红白血病细胞株K562细胞为模型，观察了端粒酶活性和细胞周期在K562细胞诱导分化过程中的改变。

材料与方法

1.细胞培养：人红白血病细胞株K562，采用常规培养。培养液为含10%小牛血清，青、链霉素各100U/ml的RPMI-1640，在37℃、饱和湿度、5%CO₂孵箱中培养，每3～4天换液传代培养。

2.药品和试剂：苦参碱(matrine, MW=248.36，纯度99.6%)和维甲酸(RA)研究室自备。端粒酶测定试剂由香港大学生物化学系谭荣安博士惠赠。

3.端粒酶活性测定^［2］：细胞用苦参碱处理不同时间后，制备端粒酶提取液。RT-PCR扩增：①逆转录：将上述提取液2 μl在25℃反应30分钟；将上述提取液在94℃灭活5分钟以作对照。②端粒酶灭活：94℃，5分钟。PCR扩增：50 μl反应体系，包括dNTP,Taq酶，生物素标记的引物I(biotin-labeled-P1)和引物II，94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，循环次数30次。平衡：72℃，10分钟。扩增产物检测：5 μl扩增产物，20 μl变性试剂，室温下孵育10分钟，加入225 μl杂交混合液，含地高辛标记的检测探针(DIG-labeled probe)，充分混匀，加100 μl混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上。之后加入抗体100 μl，18～22℃，30分钟。最后加100 μl TMB显色10分钟，测定450nm和690nm的A值(吸光度，曾称光密度OD)。根据A=A₄₅₀-A₆₉₀计算。

4.细胞周期的分析：将未处理和苦参碱处理的K562细胞分别培养一定时间后，收集细胞，用PBS清洗2次，再用冷乙醇(70%)固定24小时以上(4℃)，置流式细胞仪测定细胞周期中不同时相的细胞数。

结果

一、端粒酶活性的明显抑制

1.用药组K562细胞中端粒酶活性的改变：用苦参碱作用K562细胞2天后，出现端粒酶活性的抑制，5天后引起端粒酶活性的明显降低。这一结果提示，端粒酶活性的降低，与细胞生长抑制、分化状态有关。

2.苦参碱引起端粒酶活性的抑制是由细胞水平介导的：苦参碱作用K562细胞5天后，端粒酶活性明显降低；而用RA(RA能引起HL-60细胞的分化)作用K562细胞5天后，端粒酶活性无明显改变。同样用苦参碱直接作用未经任何诱导剂处理的K562细胞提取液，发现端粒酶活性不被抑制；用RA直接作用K562细胞提取液，端粒酶活性也无明显改变。提示苦参碱不能直接抑制端粒酶活性。

二、细胞周期的分析

采用流式细胞仪分析苦参碱对K562细胞周期的影响，分析结果显示，苦参碱作用K562细胞72小时后，细胞周期发生明显改变，G₁期细胞数由34.0%增加至47.6%，S期细胞数由56.9%显著降低为2.5%，而未经作用的K562细胞增殖正常。提示苦参碱能抑制K562细胞的DNA复制，抑制其增殖能力。

讨论

目前，关于中药诱导分化的研究尚不多见。我们发现苦参提取液能够诱导K562细胞分化，而苦参碱是从苦参中提取的一种主要成分。本研究表明，用0.1 mg/ml的苦参碱处理K562细胞一定时间后，K562联苯胺染色阳性较对照组提高，形态趋向红细胞系分化，同时，端粒酶活性明显降低。这一结果提示，端粒酶活性与细胞的分化状态有关。但是分化诱导剂影响端粒酶基因的表达还是抑制了它的酶活性，目前还不清楚。

端粒酶是近年来发现的一种特殊的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成的蛋白复合体。它的作用是在复制期(S期)的线性染色体末端添加TTAGGG重复片段，以弥补染色体由于细胞分裂出现的末端进行性缩短，而使细胞无限增殖，导致肿瘤的发生和细胞永生化。有学者报道^［3］，永生细胞的分化可以抑制端粒酶活性。本研究结果表明，增殖的K562细胞有非常高的端粒酶活性，分化的细胞端粒酶活性明显降低，没有发生分化的细胞端粒酶活性不降低。说明端粒酶活性的抑制是细胞分化过程所伴有的，提示端粒酶是肿瘤细胞增殖的指标。研究结果还表明，分化诱导剂引起端粒酶活性的降低不是直接抑制，而是一个由细胞水平介导的调控过程，提示苦参碱抑制K562细胞增殖可能与抑制端粒酶活性有关。在Bestilny等^［4］学者的实验中也证实了这一点。

有文献^［5］报道，端粒酶活性的调节具有细胞周期依赖性。苦参碱作用K562细胞后引起端粒酶活性的明显抑制，是否也引起细胞周期的改变?为此，我们观察了苦参碱作用后K562细胞周期的变化。流式细胞仪分析显示，苦参碱作用K562细胞72小时后，其G₁期细胞数由34.0%增加到47.6%，而S期细胞数由56.9%减少到2.5%，提示苦参碱能明显抑制K562细胞进入S期，抑制它的DNA复制，抑制其增殖能力。

参考文献

1张彦，蒋纪恺，秦建平，等. Induced differentiation of human erythroleukemia K-562 by matrine. 第三界亚洲临床肿瘤学会国际学术讨论会论文摘要，1996，79.

2Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266: 2011-2015.

3Sharma HW, Sokoloski JA, Perez JR, et al. Differentiation of immortal cells inhibits telomerase activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 12343-12346.

4Bestilny LJ, Brown CB, Miura Y, et al. Selective inhibition of telomerase during terminal differentiation of immortal cell lines. Cancer Res, 1996, 56: 3796-3802.

5Zhu Xueli, Rakesh Kumar, Mahitosh Mandal, et al. Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 6091-6095.

本课题受国家自然科学基金资助(No.39670881)

(收稿：1997-12-19修回：1998-03-02)