关键词： 白血病，粒细胞，慢性bcr-abl融合基因细胞凋亡寡核苷酸，反义

【摘要】目的研究bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病细胞(CML)凋亡调控中的作用。方法用人工合成的与bcr-abl mRNA(b3a2型）融合点碱基序列互补的反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）作用于体外培养的CML细胞株K562细胞，观察K562细胞凋亡的情况。结果bcr-abl融合基因表达受抑后，K562细胞凋亡显著增加。结论bcr-abl融合基因可抑制CML细胞凋亡，这可能是CML发病的主要机制。

inhibition of apoptosis by bcr-abl fusion gene in K562 cellsWang Chunhong, sun Bingzhong, Yuan Yaochuan. Department of Medicine, 316 Hospital, PLA, Beijing100093

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of bcr-abl fusion gene on CML cell apoptosis. MethodsApoptosis of in vitro cultured K562 cells was observed after exposure to synthetic 18-mer antisense oligodeoxy- nucleotide complementary to the bcr-abl junction (b3a2). Results Apoptosis of K562 cells was significantly increased associated with inhibition of bcr-abl expression. conclusionbcr-abl fusion gene formation due to chromosome translocation may be the major mechanism of CML via inhibition of apoptosis.

【Subject words】Leukemia, myeloid, chronicbcr-abl fusion geneApoptosisOligonucleotides, antisense

慢性粒细胞白血病（CML）是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其细胞遗传学特征是具有Ph染色体，即t(9;22)(q34.1;q11.2)，形成bcr-abl融合基因，构成CML具有特征性的分子生物学标志。动物实验证实它可使鼠类产生类CML白血病。为了阐明bcr-abl融合基因在CML发病中的作用，我们用bcr-abl mRNA反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN)作用于K562细胞，观察其对细胞凋亡所产生的影响，探讨CML的发病机制。

材料与方法

1.细胞系：K562细胞系细胞由第四军医大学免疫学教研室金伯泉教授惠赠。

2.试剂：ASODN序列为5′-GAAGGGCTTTTGAA- CTCT-3′，无关反义寡聚脱氧核苷酸（N-ASODN）序列为5′-CATTTCTTGCTCTCCACG-3′，均为全硫代修饰，由中国科学院上海细胞生物研究所合成。

3.细胞培养：K562细胞用含5％胎牛血清RPMI 1640的培养液培养，置37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温孵箱中培养。实验取对数生长期细胞。

4.实验分组：分为空白对照组、N-ASODN作用组和ASODN作用组。将密度为1×10⁵/ml的细胞接种于96孔板，每组设3个复孔。将10、20、40μmol/L的N-ASODN及ASODN分别加于预定孔中，培养24、48、72小时，收集细胞。

5.细胞存活率：每隔24小时对细胞进行台盼蓝染色，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(活细胞数)/((活细胞数+死细胞数))×100％

6.细胞形态观察：常规制片，G-W染色，油镜下观察细胞形态。

7.流式细胞仪检测：用pH7.4的1×PBS漂洗细胞，细胞总数为2×10⁶，加70%乙醇（预冷）5 ml，4℃冰箱保存。检测前离心去乙醇，碘化丙啶染色15分钟，上机检测。

8.bcr-abl基因表达的检测：将对数生长期的K562细胞接种于培养瓶中，细胞密度为1×10⁶/ml，分别加入终浓度为20μmol/L的ASODN及N-ASODN，置37℃，5％CO₂，饱和湿度的恒温孵箱中培养24小时。采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提RNA，筑巢式RT-PCR扩增提取物^［1］，1.5％琼脂糖电泳检测待测产物。

结果

1.细胞存活率：经ASODN作用后，K562细胞的存活率下降，这种作用随ASODN的浓度增加而增强，而对照组及N-ASODN组的细胞未受影响。

2.细胞形态：ASODN 作用24小时后，可见部分细胞形态发生了变化，其形态特点为：细胞变小，核浓缩深染，核碎裂呈团块状散布于胞浆，可见凋亡小体形成。并且随剂量的增加和作用时间的延长，发生形态变化的细胞数量亦相应增加。

3.流式细胞仪检测：40 μmol/L ASODN作用72小时组细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰－凋亡峰(apoptosis peak)，N-ASODN作用组细胞无此变化。10、20 μmol/L ASODN作用72小时组细胞，光镜下虽可见凋亡细胞，但数量较少，故凋亡峰不明显。

4.bcr-abl基因的表达：ASODN作用24小时后，bcr-abl融合基因表达降低，表现为特异扩增带荧光亮度减弱。N-ASODN不影响bcr-abl基因的表达，其扩增带荧光亮度与阳性对照一致。

讨论

CML的一个重要特征是中性中、晚幼粒细胞大量增加。过去认为其原因是由于bcr-abl融合基因促进了粒细胞增生造成的。近年研究表明，CML祖细胞的增殖力并不比正常祖细胞高^［2］，也无对生长因子更高的敏感性^［3］，bcr-abl融合基因的表达产物p210蛋白单独作用不能使造血祖细胞产生生长因子非依赖性增生^［4］。因此推测，CML中性粒细胞异常增加，是由于细胞凋亡受抑而使细胞存活延长所致。

凋亡一词源于古希腊语，用以描述细胞一种不同于坏死，且受基因调控的主动性自我消亡或自杀的过程，维持着细胞增殖与死亡之间的平衡。近年研究表明，细胞凋亡调控的异常是肿瘤发生的重要机制。本研究用bcr-abl mRNA反义寡脱氧核苷酸抑制K562细胞中bcr-abl基因的表达后，K562细胞凋亡显著增加，存活明显延长，表明bcr-abl融合基因具有抗凋亡的作用。这可能是CML发病的主要机制。

在本研究中，当K562细胞发生典型的凋亡细胞形态学改变时，DNA凝胶电泳中未能观察到典型的DNA梯状带，结果与McGahon等^［5］的报道一致。以上结果并不能否定凋亡的K562细胞中不存在DNA断裂。McGahon等用TDTA方法检测到凋亡的K562细胞中存在着DNA断裂，其原因可能系K562细胞中的染色质DNA呈单链断裂而非双链断裂。K562细胞缺乏DNA双链断裂的原因并不十分清楚，可能与核酸内切酶受抑制或缺乏有关。Wyllie^［6］报道转染了ras基因的细胞失去了核酸内切酶的活性，说明Ras蛋白可干扰核酸内切酶活性。

bcr-abl融合基因抗凋亡的机制尚不清楚。Bedi 等^［7］用离子射线照射Ba-F₃、FDC-P₁及Ba-F₃^P210、FDC-P₁^P210细胞（转染了BCR-ABLcDNA序列的Ba-F₃、FDC-P₁细胞系），Ba-F₃、 fDC-P₁细胞出现凋亡，而Ba-F₃^P210、FDC-P₁^P210细胞不出现凋亡，同时发现后两种细胞滞留于细胞周期的G₂/M限制点。由此推测，p210蛋白使细胞滞留于G₂/M限制点，从而阻止细胞进入有丝分裂阶段，使受损DNA得以修复或复制，即细胞凋亡受抑，因而受损细胞的生存延长。

综上所述，bcr-abl融合基因可抑制CML细胞凋亡，深入研究其抗凋亡的机制，必将对CML的治疗起到极大的促进作用。

参考文献

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5McGahon A,Bissonnette R,Schmitt M, et al.BCR-ABL maintains resistance of chronic myelogenous leukemia cells to apoptotic cell death. Blood, 1994,83:1179-1187.

6Wyllie AH. Apoptosis. Br J Cancer, 1993, 67:205-208.

7Bedi A, Barber JP, Bedi GC, et al. BCR-ABL-mediated inhibition of apoptosis with delay of G₂/M transition after DNA damage: a mechanism of resistance to multiple anticancer agents.Blood, 1995, 86:1148-1158.

国家自然科学基金资助课题(No.39670330)

(收稿：1997-12-12修回：1998-04-22)

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