关键词： 喉肿瘤；热休克蛋白；RNA，信使；基因表达；聚合酶链反应

【摘要】目的对25例喉癌及癌旁正常喉组织中几种主要人热休克蛋白的mRNA表达水平进行检测和比较。方法采用mRNA狭缝杂交的方法。HSP27、HSC70和HSP90β探针用PCR方法进行制备。结果HSP90α和HSP70在喉癌组织中的表达量显著高于正常喉粘膜，平均表达量均为正常喉粘膜表达量的5倍。而HSP27、HSC70和HSP90β的表达量，在两种组织中变化不大。结论与其他热休克蛋白相比，HSP70和HSP90α可能在喉癌的发生过程中有更为重要的作用。进一步深入研究它们在肿瘤和正常组织中不同表达的机理，将为热休克蛋白用于喉癌的生物治疗提供理论依据。

Comparative study of expression levels of the major human heat shock proteins in cancer and normal tissuesShi Yijiang, Zhao Mei, Xu Xianfa, et al. Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Beijing 100021

【Abstract】ObjectiveTo investigate and compare mRNA expression levels of the major human HSPs (including HSP90α, HSP90β, HSP70, HSC70 and HSP27) in 25 cases of laryngeal carcinomas and normal controls.MethodsmRNA slot blot hybridization technique was used and cDNA probes of HSP27, HSC70 and HSP90β were prepared with PCR method.Results HSP90α and HSP70 expression was significantly enhanced approximately 5 fold in laryngeal cancer tissues compared to that in the normal larynx tissues while HSP27,HSC70 and HSP90β expression was at similar levels.ConclusionThe results suggest that HSP90α and HSP70 may play more important role in the carcinogenic process of laryngeal cancer. To find out mechanisms involved will pave the way for the application of HSPs on the biologic therapy of laryngeal cancer.

【Subject words】Laryngeal neoplasmsHeat shock proteinRNA,messengerGene expressionPolymerase chain reaction

热休克蛋白是细胞在受到各种刺激时产生的一类高度保守的蛋白质^［1］。热休克蛋白主要分为90 000、70 000、27 000等家族。最近的研究发现，热休克蛋白与肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫以及机体对肿瘤治疗药物耐药性的发生和肿瘤的预后等都有密切关系。有许多报道证实，人体肿瘤组织中，热休克蛋白表达发生了改变。不同部位的肿瘤组织中，热休克蛋白表达的改变并不一致。我们采用PCR的方法，以人脾λgtll-cDNA基因库为模板，扩增人HSP90β、HSC70和HSP27的cDNA片段，并与已有的HSP90α、HSP70 cDNA片段共同用作探针。在mRNA水平上，检测并比较HSP90β、HSC70、HSP27、HSP90α和HSP70在喉癌组织和正常喉粘膜中的表达。

材料与方法

1.标本：所选喉切除标本应符合下列条件：(1)病理证实为鳞状细胞癌。(2)癌组织无溃烂、坏死；癌旁喉粘膜取自癌缘外0.5 cm以上，且经病理证实。(3)术前均未接受过放射或化学治疗。(4)能同时切取癌组织和癌旁喉粘膜100 mg左右。收集到符合上述条件的喉标本共25例，均为我院头颈外科1996年喉切除标本。其中男性16例，女性9例。年龄36～75岁，中位年龄65岁。临床分期均为T₃或T₄期。标本取出后立即送液氮速冻，并置-70℃冰箱保存待用。

2.热休克蛋白探针的制备：PCR方法制备HSP90β、HSC70和HSP27探针，按已发表的热休克蛋白核苷酸序列设计了下列引物：HSP27 上游5’GCGCGAATTCCTGGATGTCAACCAC3’，下游5’CTC- GAAGCTTACTGGGATGGTGATC3’；HSC70 上游5’TACCAAGCTTACACAGACCTTCACT3’，下游5’AAGTGAATTCTTGGATGACACCTTG3’；HSP90β，5’GTTGGAATTCAGGGCATTGCTATTT3’，下游5’TTCCAAGCTTGAGATTTTTAGAGAA3’。PCR产物克隆于质粒PUC-119，经酶切和序列测定证实，相应PCR产物正确无误。重组质粒pBS-SK-HSP90α为中国医学科学院基础研究所沈教授惠赠，pBS-SK-HSP70为美国南加州大学的Morimoto教授惠赠。以随机引物法对探针进行³²P标记。

3.分子杂交：用异硫氰酸胍-酚氯仿一步法提取组织总RNA。通过多孔过滤加样器转移至尼龙膜上，与³²P标记的热休克蛋白探针进行杂交^［2］。光密度扫描测定杂交带的积分吸光度，用β-actin进行校正。比较肿瘤组与对照组的平均表达量，并进行t检验。

结果

HSP90β、HSC70和HSP27的PCR产物凝胶电泳后，见HSP90β、HSC70和HSP27的PCR产物大小与预期相一致，分别为344bp、339bp和274bp(图1)。进一步的酶切鉴定和DNA序列测定结果证实了所扩增的HSP90β、HSC70和HSP27片段为目的片段。

1.λDNA/HindIII marker；2：HSP27 PCR产物；3：HSC70 PCR产物；4：HSP90β pCR产物

图1HSP27、HSC70和HSP90β pCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图2显示分别以HSP90α、HSP90β、HSP70、HSC70、HSP27和β-actin作为探针，对3例喉癌及癌旁正常喉组织RNA进行杂交后，放射自显影的结果。计算25例标本杂交带密度扫描的积分值发现，HSP70在喉癌组织中的表达量显著高于正常喉粘膜，平均表达量约为正常喉粘膜的5倍。类似于HSP70的表达模式。HSP90α在喉癌组织中的表达也显著增高，平均表达量为正常喉粘膜的5倍。喉癌组织HSC70的平均表达量比正常喉粘膜中略有增高，但差异无显著性。而HSP90β和HSP27在喉癌和正常喉粘膜中的表达量变化不大。

图23例标本的主要热休克蛋白mRNA狭缝杂交结果

讨论

热休克蛋白与细胞的转化和恶变过程密切相关。癌基因转化的细胞和人类恶性肿瘤细胞系中，热休克蛋白表达增高；酪氨酸激酶抑制剂格尔德霉素能通过破坏HSP90与pp60^v-src复合物的形成而使肿瘤细胞逆转^［3］；抑癌基因p53的功能有赖于它与HSP70和HSP90的结合^［4］。热休克蛋白还参与肿瘤抗原的加工和提呈，引发肿瘤特异性的MHCⅠ限制性细胞毒T淋巴细胞^［5］。肿瘤组织中的热休克蛋白和所携带的抗原决定肽还可用做肿瘤疫苗，抑制肿瘤的生长和转移^［6］。在人体恶性肿瘤组织中，常高表达HSP70。经HSP70反义DNA处理的肿瘤细胞不仅表现生长抑制，而且容易诱导凋亡^［7］。本研究中，我们发现HSP70在喉癌中表达量为正常喉粘膜中的5倍。与HSP70在多种癌组织中表达增高的报道相一致。一般认为，HSC70在组织内为组成性表达，有人发现HSC70与野生型p53在肿瘤细胞内的细胞内定位及其功能有关^［8］。本研究的结果显示，喉癌中HSC70的表达量比正常喉粘膜中略有增高。HSP90分为90α和90β两种，在病毒转化和化学诱导的人肿瘤细胞中，HSP 90α表达水平明显升高。有人报道在人胰腺癌组织中，HSP90α呈选择性高表达，而HSP90β为组成型表达。本实验结果发现，HSP90α在喉癌组织中高表达。比较70和90家族热休克蛋白在喉癌中的表达模式，发现它们都分别有一个高度诱导表达和一个相对低表达的成员，不同家族的热休克蛋白及同一家族内热休克蛋白的不同成员在肿瘤发生中各自所起的作用尚有待进一步研究。HSP27的表达在人类肿瘤组织中差异较大，其表达与肿瘤恶性程度有关。如原位乳腺癌，有HSP27高表达的患者较无HSP27表达者的无瘤生存期短^［9］，它的表达与肿瘤多药耐药的形成亦有一定的关系。在研究中我们发现，HSP27在喉癌和正常喉粘膜中表达量在相同的水平上。以上结果表明，HSP70和HSP90α可能在喉癌的发生过程中有更为重要的作用，进一步深入研究它们的作用机理，将能为热休克蛋白用于喉癌的生物治疗提供理论依据。

本课题受卫生部基金(94-1-052)中国医学科学院基金(952011)资助

参考文献

1Lindquist S, Craig NE. The heat shock proteins. Annu Rev Genet, 1988, 22: 631-677.

2Sambvook J, Fvitsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁，黎孟风，等译. 第2版. 北京：北京科学出版社，1992. 372-373.

3Whitesell L, Mimnaugh EG, Costa BD, et al. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60^v-src heteroprotein complex formation in benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:8324-8328.

4Blagosklonny MV, Toretsky J, Bohen S, et al. Mutant conformation of p53 translated in vitro or in vivo requir