关键词： 端粒酶/分析；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定；端粒重复序列扩增法

【摘要】目的为改进端粒重复序列扩增法(TRAP)存在定量困难、应用同位素及每次检测标本数受限等缺点，研究建立及评价端粒酶TRAP-ELISA法。方法端粒酶TRAP-ELISA法是将TRAP与PCR-ELISA系统结合。与常规TRAP法相比较，应用端粒酶TRAP-ELISA法检测端粒酶阳性的293细胞和阴性对照标本(加热或RNase处理和正常人内皮细胞)。结果293细胞端粒酶阳性，对10，10²，10³及10⁴个细胞检测均为阳性，所测到的吸光度值(A，曾称光密度OD)依赖于被检293细胞数。RNase或加热处理标本和正常人内皮细胞均阴性。该方法可在当日观察结果，不需放射性同位素。结论端粒酶TRAP-ELISA是一种非放射性同位素、快速及可定量的人端粒酶活性检测方法。

Detection of human telomerase activity by telomerase TRAP-ELISA assayWei lixin, Guo Yajun, Yan Zhenlin, et al. Tumor Immunology and Gene Therapy Center. Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University, Shanghai 200438

【Abstract】ObjectiveTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) is now a conventional assay for detecting telomerase activity. However, this method presents problems owing to tedious quantification, radioisotopic handling and limited number of samples that can be examined each time. In order to alleviate these inconveniences, a novel telomerase TRAP-ELISA assay for human telomerase activity was developed.MethodsTelomerase TRAP-ELISA assay is a system based on the combination of PCR-ELISA with TRAP. It was used to detect telomerase activity in 293 cells and RNase-pretreated or heat-treated cells as control.ResultsTelomerase activity assayed by TRAP-ELISA was positive when the number of 293 cells examined was 10, 10²，10³, and 10⁴. The A(formerly called OD) value depended on the number of 293 cells used in the assay. Telomerase activity of RNase-pretreated or heat-treated cells, and human normal endothelial cell was negative. The result of telomerase TRAP-ELISA was available within one day and was handled without radioisotope.ConclusionTelomerase TRAP-ELISA assay is a non-radioisotopic, fast and quantitative method for detecting human telomerase activity.

【Subject words】Telomerase/analysisPolymerase chain reactionEnzyme-linked immunosorbent assayTelomeric repeat amplification protocol

端粒是真核染色体末端的特殊结构，人端粒DNA由6碱基重复序列(TTAGGG)组成，端粒有重要的生物学功能，其中最被关注的是其在细胞衰老和肿瘤中的作用^［1］。端粒酶是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白质酶，蛋白质组分具有催化活性，其以RNA组分为模板，以端粒3’末端为引物，合成端粒重复序列^［2］。人正常体细胞端粒酶常阴性，而90%恶性肿瘤细胞和生殖细胞阳性，端粒酶检测不但是进一步研究的手段，而且有潜在的临床应用价值^［3］。目前检测端粒酶活性方法主要有两种，一是最早建立的端粒重复序列延伸法；二是端粒重复序列扩增法(TRAP)及其改良方法。但上述方法定量困难，常需同位素。本研究建立快速、简便及经济的端粒酶TRAP-ELISA法，检测人端粒酶活性。

材料与方法

1.细胞株：肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、BEL-7404及QGY-7701均由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。原代培养的正常人内皮细胞由长海医院心血管内科徐荣良博士提供，293细胞株由本中心保存。

2.主要试剂：(1)引物：根据Kim等^［3］已发表的序列，委托美国赛百盛生物工程公司合成，在引物TS(5’AATCCGTCGAGCAGAGTT)的5’端加Biotin标记。CX：5’CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA。(2)寡核苷酸探针：根据端粒的重复序列，设计并委托美国赛百盛生物工程公司合成，在5’端标记荧光素。探针序列：5’-CCCTAACCCTAACCCTAA。(3)Streptavidin购自华美生物技术公司，包被浓度为1∶50。(4)标记辣根过氧化物酶(POD)的抗荧光素抗体：购自Boehringer Mannheim公司，工作浓度为1∶1 000。

3.端粒重复序列扩增(TRAP)：参照文献［3］方法制备端粒酶抽提液。参照文献［3，4］略加改进行端粒重复序列扩增，采用生物素标记的TS引物以使扩增的产物能固化ELISA板上。平行对照组于检测前经RNase A或65℃10分钟处理。

4.ELISA检测：参照Lungu等^［5］方法进行改良，1∶50的streptavidin包被聚氯乙烯板，50 μl/孔4℃过夜。次日以2×SSC(0.15 mol/L NaCl，15 mmol/L柠檬酸钠)洗涤4次，每孔加40 μl杂交液(含200 μl/ml鲑鱼精子DNA的5×SSC)及10 μl TRAP反应产物液，混匀37℃30分钟，每孔用2×SSC洗2次；每孔中加入200 μl变性液(0.5 mol/L NaOH)室温下5分钟，将变性液移出，2×SSC液洗2次，每孔加入100 μl溶解于杂交液中的20 pmol荧光素标记的端粒重复序列探针，50℃温育30分钟后，2×SSC液200 μl冲洗2次；用200 μl洗液(0.1 mol/L Tris-HCl pH7.5, 0.3 mol/L NaCl, 0.2 mol/L MgCl₂, 0.05% Tween-20)洗2次，抗荧光素-POD抗体用孵育液(0.1 mol/L Tris-HCl pH7.5, 0.3 mol/L NaCl, 0.2mol/L MgCl₂, 0.05% Tween-20，1%牛血清白蛋白)1∶1 000稀释后，每孔加100 μl，室温下孵育60分钟，孵育后，每孔用200 μl洗液洗3次；然后加入100 μl含邻苯二胺(OPD)的底物缓冲液，使用前H₂O₂激活，37℃下反应进行20分钟，以15 μl 2 mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联计数仪492 nm读取A值。

5.阳性反应域值的确定：每份标本同时检测，65℃加热处理10分钟。处理和未处理标本，A值≥0.2，未加热/加热≥2，均为阳性。

结果

1.PCR反应循环数的确定：为确保检测能在对数增长期内进行，需要在较少的循环数内检测扩增端粒重复序列产物，由图1可以看出，在25～35之间，A值与循环数呈线性关系，35～45循环已达平台期。RNase处理的阴性对照未见非特异性反应。综合考虑选30循环数。

2.端粒酶TRAP-ELISA法与常规TRAP法的比较：相同的293细胞标本，先行常规的TRAP法检测(图2)，再应用端粒酶PCR-ELISA法检测。行端粒酶PCR-ELISA法检测时，重复3次以上结果。两种方法结果一致。经RNase 37℃20分钟处理及加热65℃10分钟处理的1 000个293细胞标本，A值均＜0.2；而未经处理的10，100及1 000个293细胞，A值均＞0.2，延伸反应时，缺dGTPA值＜0.2，而缺dCTPA值＞0.2(图3)。

图1端粒酶TRAP-ELISA法的PCR循环数确定

1：293细胞；2：RNase⁺；3：加热处理；4：延伸时缺dGTP；5：延伸时缺dCTP；6：对照引物；7：裂解液对照；8，9，10：分别为293细胞；10¹、10²、10³个细胞

图2同位素TRAP检测端粒酶的特异性及敏感性

3.肝癌细胞端粒酶活性检测：应用常规TRAP法已证实4株人肝癌细胞株的端粒酶阳性^［4］。采用端粒酶TRAP-ELISA法检测相同标本，4株人肝癌细胞A值均在0.2以上，而未加热/加热的比值均＞2，呈阳性；而人正常内皮细胞A值在0.2以下，而未加热/加热的比值均＜2，呈阴性(图4)。

讨论

端粒是真核染色体末端的特殊结构，人端粒由6碱基重复序列(TTAGGG)和端粒结合蛋白组成，端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体、防止染色体末端融合、保护染色体结构基因及调节正常细胞生

1：293细胞；2：RNase⁺；3：加热处理；4：延伸时缺dGTP；5：延伸时缺dCTP；6：对照引物；7：裂解液对照；8，9，10：分别为293细胞；10¹、10²、10³个细胞

图3端粒酶TRAP-ELISA法的特异性及敏感性

1：QGY-7701肝癌；2：BEL-7402肝癌；3：BEL-7404肝癌；

4：SMMC7721肝癌；5：人正常内皮细胞